HIV感染者口腔白假丝酵母菌的群体生长规律研究方法与结果
目的：了解HIV感染者口腔白假丝酵母菌的群体生长规律，为口腔念珠菌病的发病机理研究、诊断及防治提供基础。方法：将108株经两次激活的分离自HIV感染者和健康人群口腔的白假丝酵母菌接种于YPD液体培养基37℃培养15 h，每间隔1 h取样采用血球计数板活菌计数法计算活菌数，同时用酶标仪测定OD600值，绘制生长曲线并计算代时。结果：绘制了分离自HIV感染者和健康人口腔的白假丝酵母菌的生长曲线，0～3 h为迟缓期，4～10 h为对数生长期，稳定期开始于10 h，两组白假丝酵母菌的生长曲线基本相似。108株白假丝酵母菌的代时为1.568 h，其中HIV感染者白假丝酵母菌代时为1.354 h，健康人群白假丝酵母菌的代时为1.782 h，HIV感染者来源的白假丝酵母菌生长速度比健康人群来源的白假丝酵母菌快0.428 h，但差异无统计学意义。结论：HIV感染者和健康人群口腔白假丝酵母菌的生长曲线各个时期基本一致，HIV感染者口腔白假丝酵母菌生长速率较健康人群稍快，在口腔念珠菌病致病中的作用需要进一步研究。
1材料与方法
1.1实验菌株及菌株的激活分离自云南地区HIV感染者、健康人群的口腔白假丝酵母菌各54株，经形态染色、培养特性、芽管形成试验、假菌丝及厚膜孢子形成试验、YBC酵母鉴定卡及CHROMagar培养基培养综合鉴定〔5〕。将冻存的实验菌株接种到YPD琼脂平板培养基（含1%酵母提取物，1%蛋白胨，2%葡萄糖，2%琼脂，pH为5.6；酵母提取物购自OXOID，蛋白胨为SLARBIO，葡萄糖及琼脂购自AMRESCO），35℃培养24 h。取单个菌落再次接种到YPD琼脂平板培养基上，培养24 h后取单个菌落接种到5 mL YPD液体培养基中，置水浴恒温培养箱中，37℃、160 r/min，过夜培养〔6-7〕即可用于本实验。
1.2白假丝酵母菌培养及生长测定取经YPD培养基两次激活的菌株，用血球计数板计数活菌细胞数，接种到15 mL YPD液体培养基中，使其细菌终浓度为1×106个/mL。置水浴恒温培养箱37℃、160 r/min培养。每隔1 h计数1次，持续15 h。白假丝酵母菌在营养较好的液体培养基中培养一段时间后会出芽，若芽体达到母细胞大小的一半时，作为2个菌细胞计数；芽体小于母细胞一半时为1个菌细胞。酶标仪测定法是在上述时间点，取培养菌液250μL到96孔细胞培养板，用连续波长酶标仪测定菌悬液的OD600〔8-9〕。由于白假丝酵母菌在营养较好的液体培养基中生长速度快，为保证实验结果的准确性，每次实验最多只测定6株菌。实验重复2次，取平均值。
1.3生长曲线的绘制血球计数板计数法的生长曲线：计算所有实验菌株的每一时间测定点的活菌数的均数，以培养时间（h）为横坐标，每一时间测定点活菌数的均数（×106个/mL）的对数为纵坐标，用EXCEL绘图。酶标仪测定法的生长曲线：计算所有实验菌株的每一时间测定点的OD600的均数，以培养时间（h）为横坐标，每一时间测定点OD600的均数为纵坐标，用EXCEL绘图。
1.4实验菌株的代时计算代时是从生长曲线算出细胞每分裂一次所需要的时间，参照文献〔8-9〕进行计算。代时以G表示，其计算公式为：G=（t2-t1）/〔（1ogN2-logN1）/log2〕，式中t1和t2为所取对数期两点的时间；N2和N1分别为相应时间测得的菌细胞数。
1.5统计学分析采用EXCEL软件和SPSS16.0统计软件进行数据的分析处理，样本均数间比较用方差分析。
2结果
2.1口腔白假丝酵母菌临床分离株的生长曲线
用血球计数板计数法和酶标仪测定法绘制的实验菌株的生长曲线，两种方法绘制的108株口腔白假丝酵母菌的生长曲线表现为0～3 h为迟缓期，4～10 h为对数期，稳定期开始于10 h，其中两种方法测定的迟缓期及对数生长期基本一致。结果显示，HIV感染者和健康人群口腔白假丝酵母菌表现出相似的生长曲线。见图1-4。
图1血球计数板计数法测定1 0 8株白假丝酵母菌临床分离株生长曲线
图2血球计数板计数法测定H I V感染者和健康人群白假丝酵母菌生长曲线
图3酶标仪法测定1 0 8株白假丝酵母菌临床分离株生长曲线
图4酶标仪法测定H I V感染者和健康人群白假丝酵母菌生长曲线
2.2口腔白假丝酵母菌临床分离株的代时代时是指菌细胞分裂数量倍增所需的时间。参照文献〔8-9〕计算得到108株白假丝酵母菌的代时为1.568 h，其中HIV感染者人群白假丝酵母菌代时为1.354 h，健康人群白假丝酵母菌的代时为1.782 h，HIV感染者人群来源的白假丝酵母菌生长速度比健康人群来源的白假丝酵母菌快0.428 h。采用SPSS16.0对HIV感染者口腔白假丝酵母菌和健康人群口腔白假丝酵母菌总体代时均数进行方差分析，差异无统计学意义（P=0.932＞0.05）。
接收部分中，激光经过模拟前端后得到中心频率为22 MHz的中频信号，模拟前端整体结构如图1所示，中频模拟信号经过ADC芯片采样后转换为数字信号，进入软件接收机，输出实时频率跟踪数据和基带信号，并发送至控制主机中，最后的跟踪结果由FFT估计的频率以及数字基带信号共同得到。
2.3血球计数板计数法与酶标仪OD600测定法的比较以OD600值为横坐标，血球计数板计数的自然对数为纵坐标，绘出对数生长期OD600与菌细胞数间函数关系的回归曲线，回归方程为：Y=2.443 7X+1.015 4，决定系数r=0.936 2，显著性检验结果：F=73.314，P=0.00＜0.01，表明回归方程差异有统计学意义。见图5。通过Spearman秩相关计算OD600值和血球计数板计数的自然对数的相关系数为0.920，经秩相关系数的统计推断P＜0.05，说明血球计数板计数法和酶标仪测定法相关性好。
图5 OD600与菌细胞数的关系
3讨论
大约50%～95%的HIV感染者在发展为AIDS的过程中以口腔念珠菌病为首发症状，尤其以口腔白假丝酵母菌病最为常见，患者的生存质量受到严重的影响，可发展成食管或全身白假丝酵母菌病，威胁病人生命〔10-12〕。生长曲线是描述微生物生长的一种特殊的曲线，是微生物在培养中所表现出来的生长和繁殖的规律，不同的菌种可表现出不同的生长曲线，同一种微生物在不同的培养条件下，其生长曲线也不同。白假丝酵母菌的群体生长过程主要经过4个阶段：①迟缓期：此期念珠菌代谢活跃，为分裂繁殖做准备，但并不繁殖；②对数期：念珠菌快速繁殖，数目呈几何级数增加；微生物形态、染色性、生理活性最典型、对抗生素最敏感；③稳定期：又称恒定期或最高生长期，处于稳定期的微生物，新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，整个培养物中二者处于动态平衡，此时生长速度，逐渐趋向零；④衰亡期：活的白假丝酵母菌总数下降，代谢逐渐停滞。白假丝酵母菌的生长速度与致病相关，当白假丝酵母菌的生长速度小于口腔的清理速度时，清理起主要作用；白假丝酵母菌的生长速度和口腔的清理速度相近时，就会有菌落形成；若白假丝酵母菌的生长速度大于口腔的清理作用时，就会出现组织的损伤，导致口腔白假丝酵母菌病〔11-14〕。由一个细胞分裂成为两个细胞的时间间隔称为世代，一个世代所需的时间就是代时。Thewes等〔6〕通过测定OD600绘制了在YPD液体培养基中的两个标准株SC5314和ATCC10231的生长曲线，发现生长率对不同白假丝酵母菌株的致病性有一定的影响，毒性和侵入性都较强的标准株SC5314比ATCC10231世代时间稍短。本研究测得的HIV感染者口腔白假丝酵母菌生长速度比健康人群平均快0.428 h，前者代时相对较短，生长较快，可能与致病有关，但目前国内外尚未见类似报道。
目前测定真菌生长曲线的方法很多，有平板稀释法、血球计数板计数法、染色法、浊度法、菌体干重法等。血球计数板计数法结果准确可靠，可计数活细胞，但耗时长，操作步骤繁琐，工作量大。在本研究中，我们同时用酶标仪测定白假丝酵母菌菌液的OD600值，结果与血球计数板计数法进行比较，发现用酶标仪法和活菌计数法所测出的口腔白假丝酵母菌生长曲线趋势基本一致，两种方法的结果在对数期有很好的相关性，而进入稳定期后由于死菌数的增加，酶标仪法无法区分活细胞与死细胞，导致酶标仪法测定的生长曲线的平台期与活菌计数法有所不同。但酶标仪测定法具有菌液用量少、快速、灵敏、操作简单、重复性好的特点，而且根据OD600值绘得的生长曲线在一定程度上是可以反映白假丝酵母菌总的生长趋势，因此在严格控制实验条件下，在对数生长期可以使用测定培养液的OD600值来推算菌细胞数代替菌细胞计数方法，也可以根据OD600值作为判断白假丝酵母菌生长是否进入对数生长期。