温带的蜡样芽孢杆菌噬菌体分离与鉴定
研究简介：芽孢杆菌属可分为两类:枯草芽孢杆菌属和蜡样芽孢杆菌属。后者的成员包括炭疽杆菌、炭疽杆菌、蜡样杆菌、威亨斯特法氏杆菌、图林根氏杆菌、分枝杆菌和假菌类。蜡样芽孢杆菌和威氏芽孢杆菌与食源性疾病和食物腐败有关。它们的催冷特性使它们在低温贮藏的食品中产生问题，特别是在乳制品中。苏云金杆菌、分枝杆菌和拟杆菌也被发现会导致食物变质。此外有证据表明它们可能导致食源性疾病。虽然迄今已分离出大量的芽孢杆菌噬菌体，但对蜡样芽孢杆菌噬菌体进行了详细的鉴定的研究较少。本论文的研究中，研究人员分离到一种溶性噬菌体vB_BceM_Bc431v3，该噬菌体具有很强的控制蜡样芽胞杆菌的潜力。在将其应用于食品保存之前，研究人员对其进行了相关鉴定并确认其不会影响这种细菌的致病性。
本论文研究的目的是确定噬菌体Bc431v3的基因组序列，并结合科学文献和GenBank中现有的噬菌体对其基因进行注释和结构功能鉴定。Biosense生长曲线分析仪的高通量测试技术测定宿主特异性，研究过程中选定了芽胞杆菌属的菌株Bc431v3，利用Biosense生长曲线分析仪，通过仪器的高通量测试技术测量在液体介质的光密度(OD)来监测细菌噬菌体的存在。
芬兰Biosense全自动生长曲线分析仪的应用
Biosense生长曲线分析仪的高通量测试技术可用于测定噬菌体对宿主细菌的特异性。噬菌体的宿主细菌选定了芽胞杆菌属的菌株Bc431v3，利用现场的测试技术，Biosense生长曲线分析仪的高通量测试技术测量在液体介质的光密度(OD)来监测细菌噬菌体的存在。该设备的使用设置如下:设定宽波段带(wb)波长;25°C培养温度;10分钟预热时间;动态测量;测量时间24小时，间隔30分钟，每次测量前后中等强度摇晃10秒。50毫升的噬菌体溶菌产物转移到已经消毒的消毒100孔Biosense蜂窝板中,然后每个孔接种125μl经过一夜培养的细菌培养液。利用Biosense生长曲线分析仪的数据处理软件5.26版对吸光度数据进行分析，确定检测时间(每口测试孔增加0.3 OD单位所需的时间)。将检测时间(h:min)转换为十进制值，取平均值，并从每个被测分离物的所有测试数据中减去平均控制检测时间，并表示为检测时间差。根据宿主特异性将噬菌体分为三组:(++)即噬菌体完全抑制宿主菌生长时;(+)说明噬菌体延缓了宿主细菌的生长;（-）表明噬菌体对细菌的生长没有影响。
实验结果：Bc431v3显示显著的序列相似性,在蛋白质水平到B仙人掌噬菌体BCP78、李斯特菌噬菌体A511、噬菌体ØEF24C肠球菌和噬菌体感染相关的其他形态厚壁菌门如葡萄球菌噬菌体K和乳酸菌噬菌体LP65。基于这些数据将Bc431v3作为Spounavirinae的一员;然而由于所有不同的分类信息已被处理很难确定属。Bc431v3噬菌体包含一些高度不寻常的基因，如gp143编码假定的tRNAHis鸟苷转移酶。此外它携带的一些基因似乎与宿主的孢子调节有关。这些是gp098，它编码与FstK/SpoIIIE DNA转运蛋白相关的分离蛋白;gp105，一种推测的分离蛋白;gp108,RNA聚合酶sigma因子F/B;以及编码RNA聚合酶西格玛因子G的gp109。
图1、已知有毒和无毒基因的混合物转化效率的差异。柱状图显示了两个不同基因复制的样品的CFU/ng值的平均值。
图2、利用Biosense生长曲线分析仪测试分离的噬菌体宿主范围。
图3、使用全自动生长曲线法确定噬菌体Bc431v3裂相对的裂解尺寸与时间的关系。
图4、Biosense生长曲线分析仪应用于测试不同菌株芽孢杆菌中添加噬菌体Bc431v3后的代表性微生物生长曲线图，该噬菌体能够完全抑制蜡样芽孢杆菌LJH431的生长(完全裂解++）。而只延迟了B.cereus PAL 25的生长(部分裂解;+)。另一方面，c431v3既不能抑制也不能延迟枯草杆菌C1004的生长。蜡样芽孢杆菌LJH431是指在没有噬菌体Bc431v3的情况下，蜡样芽孢杆菌LJH431的生长情况。
图5、利用CGview制备噬菌体Bc431v3的遗传和物理图谱。Blast 1显示了噬菌体Bc431v3蛋白与B.cereus噬菌体Bcp78蛋白的序列同源性。Blast 2显示了噬菌体Bc341v3与李斯特菌噬菌体A511之间的序列同源性。裂解3显示了序列之间的同源性噬菌体Bc431v3和噬菌体ØEF24C肠球菌。在这些案例中，TBLASTX被用来在蛋白质水平上搜索序列相似性。
总结：因为很少有蜡样芽孢杆菌噬菌体被分离出来并被详细描述。因此研究人员对一些温带的蜡样芽孢杆菌噬菌体进行了鉴定，并将其用于蜡样芽孢杆菌的转导分析。此外还有许多裂解性噬菌体已被分离出来，并用于流行病学研究的噬菌体分型方案。噬菌体分型被认为是一种有效的方法，特别是因为蜡样芽胞杆菌、图林根芽胞杆菌和炭疽芽胞杆菌之间有密切的亲缘关系，为鉴定如此接近的物种提供了一种便宜、方便和相当准确的工具。研究人员提供了分离出一种大的、有毒的、广泛的宿主范围的蜡样芽孢杆菌噬菌体vB_BceM_Bc431v3的数据(Bc431v3)。Bc431v3有一个158,618 bp的dsDNA基因组，包括239个假定的开放阅读框(ORFs)和20个tRNA基因，它们编码17种不同的氨基酸。研究人员为了确定噬菌体Bc431v3的基因组序列，并结合科学文献和GenBank中现有的噬菌体对其基因进行注释和结构功能鉴定。
采用了Biosense生长曲线分析仪的高通量测试技术测定宿主特异性，选定芽胞杆菌属的菌株Bc431v3，利用Biosense生长曲线分析仪，通过仪器的高通量测试技术测量在液体介质的光密度(OD)来监测细菌噬菌体的存在。根据宿主特异性将噬菌体的生长曲线图将所得的实验分为三组:(++)即噬菌体完全抑制宿主菌生长时;(+)说明噬菌体延缓了宿主细菌的生长;（-）表明噬菌体对细菌的生长没有影响。这也说明全自动生长曲线分析仪在鉴定噬菌体的相关性能方面具有很好的应用前景。