不同pH磷酸盐缓冲液中药物视频显微溶出测度
越来越多的制药工业管线中的候选药物表现出较差的水溶性，大多数已上市的口服速释制剂几乎不溶解。这些药物通常生物利用度低且不一致，在生物药剂学分类系统中被归类为II类和IV类（低溶解度）药物。为了对新化学实体(NCE)进行分类和表征，需要有效的溶解速率早期筛选方法，该方法可以使用少量材料进行。在过去几年中，人们对早期NCE开发中的高通量方法（可以同时评估多个条件和样品）的兴趣急剧增加。由于实验室自动化技术的进步，现在可以以最少的材料要求筛选大型化学和配方空间。制药行业在高通量实验的实施和开发研究制剂前条件的系统方法方面投入了大量资金。使用原位成像技术，可以实时监测溶解过程以及与起始材料不同形态的其他不溶性沉淀物的形成。该技术还可以更好地理解药物颗粒在溶液中的行为，而不是通过单独评估颗粒大小和形态进行批量测量。研究在非常小的样品体积中溶解的方法可能是视频显微镜设置，例如oCelloScope微生物动态监测系统（BioSense）。对标准曲线和紫外吸收行为知识的需求被溶解颗粒显微照片的图像分析所取代，因为测量的是观察到的二维(2D)颗粒面积的减少而不是特定的药物浓度。这种视频显微装置能够获取药物颗粒随时间溶解的高分辨率图像，并且之前已被用于研究过饱和系统中的微生物生长和沉淀。
本研究的目的是开发一种微克级视频显微方法来预筛选和估计水溶性差的药物的溶出度。该方法用于研究6种水溶性差的药物（卡维地洛、地西泮、双嘧达莫、非洛地平、非诺贝特和消炎痛）在禁食状态模拟肠液(FaSSIF)中、消炎痛在不同pH磷酸盐缓冲液中的溶出度，以及在定制的生物相关介质中使用地西泮和双嘧达莫。选择这些药物来代表早期药物开发过程中感兴趣的微水溶性候选药物。另一个目的是评估药物颗粒溶解时的形态，确定它们的粒度分布，并跟踪卡马西平在磷酸盐缓冲液中的固态转化迹象。
丹麦Biosense微生物生长曲线监测系统的应用
使用oCelloScope微生物动态监测系统（BioSense）进行药物的视频显微溶出测试。该设备以设定的时间间隔获取图像以生成延时视频，使用6-96孔微量滴定板作为样品容器，显微镜单元带有连接到机械臂的摄像头和照明源，用于获取样品内容的图像井。1.3μm显微镜的光学分辨率允许检测0.5μm和1 mm之间的微型物体，使其适用于药物颗粒、微粉化颗粒和新结晶颗粒的显微镜检查，因为这些通常适合可观察的尺寸区间。oCelloScope微生物动态监测系统具有4倍光学放大倍率，可在2分钟和36秒内扫描完整的96孔板。该设备通过一组定制的图像分析算法分析获得的溶解图像。图像分割算法通过结合使用形态图像重建和纹理分析对图像进行二值化来识别图像中存在的粒子。为了分离连接的粒子，二值化图像通过结合二值掩模和灰度图像的测地线分水岭变换进一步处理和细化。对于所有已识别的颗粒，颗粒形状和形态参数，例如面积、具有等投影面积(EQPC)的圆的直径和Feret直径，均根据国际ISO 9276-6标准进行测量。
实验结论
在这项研究中证明了视频显微溶出测试可用于根据溶出速率对药物进行分组，以及研究和跟踪溶出过程中的相变行为和沉淀，而传统方法通常需要额外的测试。这一发现突出了使用基于显微镜的溶出方法的优势之一，因为在开发过程的早期描述NCE的溶出行为对于进一步的药物开发至关重要。视频显微溶出度测试可以使用低至480μg的药物和4.3 mL的介质进行24个孔，使其成为早期NCE开发过程中的有效溶出筛选方法。使用oCelloScope微生物动态监测系统的视频显微装置可作为概念证明，在进一步开发后，它可以用作药物开发早期阶段的调查筛选工具，并在开发过程中协助决策。
图1、FaSSIF中消炎痛溶出实验的24个孔中所有粒子的溶出率，作为其各自粒子面积的函数。
图2、a）显示消炎痛颗粒的视频显微溶出测试的原始输出图像。b）图像分析算法识别的消炎痛颗粒，如蓝色边界框所示，以及由红色轮廓可视化的暴露表面。c）来自单个颗粒的消炎痛溶出数据的线性回归，显示溶出速率为10.11μm2 min-1。R2=0.988
图3、在pH 6.5的FaSSIF中卡马西平颗粒的30分钟延时。b为识别和分析粒子而开发的算法无法将不透明粒子和透明粒子彼此分开。红色箭头表示存在柱状卡马西平沉淀；蓝色箭头表示存在针状卡马西平沉淀。
图4、视频-显微溶出度测试数据与常规小规模溶出度测试数据的相关图。R 2=0.87，斯皮尔曼的ρ=0.92，p=0.0013。进行了单向方差分析统计检验。(**):p=0.0012;(****)：p<0.0001。●：地西泮，■：卡维地洛，▲：消炎痛，⧨：消炎痛pH 6.0，⬖：消炎痛pH 6.5，○：消炎痛pH 5.5，□：双嘧达莫，△：非洛地平，▽：非诺贝特。
图5、不同浓度胆汁盐和溶血磷脂对视频显微试验。a）双嘧达莫和b）地西泮以及常规小规模溶出试验中c）双嘧达莫和d）地西泮溶出度的影响。溶血磷脂(LPL)浓度对e）双嘧达莫和f地西泮溶出率的影响。左侧y轴(●)为视频显微溶出测试数据，右侧y轴(○)为常规小规模溶出测试数据。进行了单向方差分析统计检验。
总结
本文讨论的方法可以在未来开发有效的抗菌化合物以改善卫生和全球食品安全方面发挥关键作用。水溶性差是新候选药物的共同特征，这导致口服生物利用度低或不一致。这引发了对溶解度和溶出度的材料有效测试的兴趣。本论文目的是开发一种微克级视频显微方法（Biosense微生物动态监测系统）来筛选水溶性差的药物的溶出率。该方法应用于禁食状态模拟肠液(FaSSIF)中的六种药物（卡维地洛、地西泮、潘生丁、非洛地平、非诺贝特和吲哚美辛）、不同pH缓冲液中的吲哚美辛以及定制培养基中的地西泮和潘生丁。另一个目的是跟踪FaSSIF中卡马西平的相变。通过使用光学视频显微镜（Biosense微生物动态监测系统）随时间跟踪颗粒表面积来研究药物的溶出速率和颗粒行为。一种设计视频显微溶出方法的方法是使用96孔微量滴定板作为样品容器，如在oCelloScope微生物动态监测系统中，该方法可以同时运行多个实验，样品体积很小。当使用96孔微量滴定板进行溶出实验时，所使用的介质体积和药物质量会大大降低。将显微镜连接到机械臂上，所有重复均以一致的方式自动执行溶出数据采集。与视频显微镜设置一样，应用微型紫外光谱溶解产生了类似的溶解速率和pH效应分组。使用定制介质表明溶血磷脂提高了地西泮和双嘧达莫的溶出速率。视频显微镜设置允许随着时间的推移跟踪溶解的卡马西平颗粒上透明颗粒的成核。开发的设置提供了一种材料有效的筛选方法，可根据溶出率对药物进行分组，其中使用光学显微镜有助于实现高样品通量。使用定制介质表明溶血磷脂提高了地西泮和双嘧达莫的溶出速率。视频显微镜设置允许随着时间的推移跟踪溶解的卡马西平颗粒上透明颗粒的成核。开发的设置提供了一种材料有效的筛选方法，可根据溶出率对药物进行分组，其中使用光学显微镜有助于实现高样品通量。使用定制介质表明溶血磷脂提高了地西泮和双嘧达莫的溶出速率。视频显微镜设置允许随着时间的推移跟踪溶解的卡马西平颗粒上透明颗粒的成核。开发的设置提供了一种材料有效的筛选方法，可根据溶出率对药物进行分组，其中使用光学显微镜有助于实现高样品通量。