微生物计数仪在食品中霉菌和酵母计数能力验证中的效果评价
摘要： 目的:参加中国检验检疫科学研究院测试评价中心组织的食品中霉菌和酵母计数能力验证。方法:按照参试指导书对样品进行复原，依据《食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数》(GB 4789.15—2016)进行定量检测。结果:2个样品20-V001和样品20-W761都取得满意结果。该方法测得样品20-V001中霉菌和酵母总数为250 CFU·mL-1，样品20-W761中霉菌和酵母总数为660 CFU·mL-1。结论:实验室的能力验证可提高实验室检验人员的微生物检测能力和水平，为今后的微生物检测提供依据。
霉菌和酵母菌广泛分布于自然环境中，它们在食品上可以作为正常菌相的一部分，或者作为空气传播性污染物，在不规范的消毒设备上也可被发现。各类食物遭受霉菌和酵母菌的侵袭，常常发生霉坏变质，有些霉菌的有毒代谢产物可能引起各种急性和慢性中毒，特别是有些霉菌毒素具有强烈的致癌性。目前，已知的产毒霉菌有青霉、曲霉和镰刀霉等，它们在自然界分布较广，对食品侵袭的机会也较多。因此，对食品加强霉菌的检验，在食品卫生学上具有重要意义。
笔者所在实验室参加了中国检验检疫科学研究院测试评价中心组织的食品中霉菌和酵母计数能力验证，通过实验室间比对，来评价参加者的能力，旨在提高微生物实验室检验人员的检测能力和水平，增强微生物实验室的竞争力。
1 材料与方法
1.1 测试样品
食品中霉菌和酵母计数能力验证样品数为2个，样品编号为20-V001和20-W761，由中国检验检疫科学研究院测试评价中心提供。
1.2 试剂与仪器
9 mL 0.85% 生理盐水（批号200408），孟加拉红琼脂（批号080708），高压蒸汽灭菌锅，生化培养箱，90 mm培养皿，电子天平。µCount3D微生物立体计数仪（丹麦BioSense公司）。
1.3 实验方法
按照《ACAS-PT900（2020）食品中霉菌和酵母计数能力验证》参试指导书和《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》（GB 4789.15—2016）的要求进行操作、培养和计数。
1.3.1 样品前处理
样品需要用60 mL稀释液再水化；样品开启后，立即加入5 mL稀释液进行再水化，待充分溶解后，吸出放入无菌瓶中，再反复用余下的稀释液清洗西林瓶内壁，回收清洗液放入上述无菌瓶中，此溶液即是待测样品原液（10²）。为保证实验数据的可靠性，本次实验共设计了6个稀释梯度。
1.3.2 样品稀释
待到样品原液经过一系列处理之后，取出1 mL加入9 mL生理盐水试管中，充分混匀，制成10¹样品匀液，同法操作制备10倍稀释样品匀液，使其达到10⁵。
1.3.3 µCount3D微生物立体计数仪检测
在无菌条件下，将上述每个稀释度的样品匀液分别吸取1 mL于2个无菌平皿内，标号为a和b。同时分别取1 mL无菌稀释液加入2个无菌平皿作空白对照。倾注冷却至46 ℃的孟加拉红琼脂倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。待培养基完全凝固后，置于（28±1）℃的培养箱中培养，观察并记录培养至第5 d的结果。
培养结束后，将各平皿依次放入丹麦BioSense公司µCount3D微生物立体计数仪中进行自动计数。该仪器采用三维立体成像技术，可自动识别霉菌菌丝蔓延区域与酵母菌落，并对重叠菌落进行智能分割，有效避免了传统人工计数中因菌落蔓延或微小菌落漏计导致的误差。仪器自动输出每个平皿的霉菌计数、酵母计数及霉菌和酵母总数，无需人工目视判读。
1.3.4 计数与报告
µCount3D仪器自动完成计数后，按照GB 4789.15—2016标准和能力验证所附的结果报告单的要求严格进行数据整理和报告。填好记录报告单后，校核人员还要仔细查看，防止出现错误。
2 结果与分析
2.1 样品检测结果
中国检验检疫科学研究院测试评价中心的2份测试样品经µCount3D微生物立体计数仪自动计数后的具体结果如表1和表2。
表1 样品Z-V001测试结果表
| 稀释度 | 霉菌 | 酵母 |
霉菌和酵母计数 报告值/CFU·mL⁻¹ |
||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| a皿落数 | b皿落数 | 平均值 | 报告值/CFU·mL⁻¹ | a皿落数 | b皿落数 | 平均值 | 报告值/CFU·mL⁻¹ | ||
| 10² | 蔓延生长 | 蔓延生长 | — | 34 | 34 | 34 | |||
| 10³ | 15 | 29 | 22 | 4 | 3 | 3.5 | |||
| 10⁴ | 3 | 6 | 4.5 | 220 | 0 | 0 | 0 | ||
| 10⁵ | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 34 | 250 | |
| 10⁶ | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |||
| 空白 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |||
| 稀释度 | 霉菌 | 酵母 |
霉菌和酵母计数 报告值/CFU·mL⁻¹ |
||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| a皿落数 | b皿落数 | 平均值 | 报告值/CFU·mL⁻¹ | a皿落数 | b皿落数 | 平均值 | 报告值/CFU·mL⁻¹ | ||
| 10² | 蔓延生长 | 蔓延生长 | — | 77 | 75 | 76 | |||
| 10³ | 58 | 59 | 58.5 | 7 | 6 | 6.5 | |||
| 10⁴ | 9 | 7 | 8 | 590 | 0 | 0 | 0 | ||
| 10⁵ | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 76 | 660 | |
| 10⁶ | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |||
| 空白 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |||
2.2 能力验证结果
此次检测结果样品20-V001和20-W761霉菌和酵母计数分别为250 CFU·mL⁻¹和660 CFU·mL⁻¹，评价值Z值分别为0.1和-0.1。通过权威的验证组织来评价上述检测出的相关结果，Z
＜2为满意结果，可见，此次检测结果是满意的。由此可知，该实验室具备良好的霉菌和酵母计数检验水平和能力。
2.3 结果分析
实验室要做好能力验证，检测过程中必须控制好每一个步骤，才能保证检验结果的准确有效。在能力验证实验前需要做好前期的准备工作，包括人员安排、培养基和试剂、相关实验仪器、试验方法等。试验用培养基和试剂要进行监控，确保其在有限期内。实验用器材要经过严格的灭菌，防止这些检验器材被污染，影响检验结果。样品液在制备和稀释的过程中，要确保试液混合均匀，否则影响计数结果。在实验过程中，为避免环境因素的影响，实验要设置空白对照组，保证实验结果的准确性。
本次实验引入µCount3D微生物立体计数仪进行自动计数，相较于传统人工目视计数，具有以下优势：（1）对霉菌蔓延生长的平皿，仪器可通过三维立体成像区分菌落边缘与蔓延区域，自动选取可计数区域进行换算，有效解决了蔓延生长导致的人工计数困难问题；（2）仪器可同时识别并区分霉菌与酵母菌落，自动分类输出两类计数结果，减少了人工判读的主观性；（3）自动化批量处理，大幅提高了计数效率和一致性，尤其适用于大批量样品的能力验证任务。
3 结论
本次实验室能力验证结果为满意，说明笔者所在实验室测定霉菌和酵母计数时可以取得准确的结果，符合相关的质量标准和要求，也能更好地为地方食品安全事业的健康发展贡献应有的力量。实验室能力验证是评价实验室技术能力的一种手段，可以真实可靠地反映出实验室所具备的检测能力，同时也有助于提升实验室的市场竞争力。µCount3D微生物计数仪的引入进一步提升了计数环节的准确性和效率，为今后同类检测工作提供了可靠的技术保障。