小反刍兽疫病毒生长曲线绘制及生长特性分析
将含高滴度小反刍兽疫病毒的新鲜病料研磨后接种VERO DS细胞系进行病毒分离，出现细胞病变后连续传代，取3代以上培养物，进行RT-PCR和间接免疫荧光试验及生长曲线测定。生长曲线测定分别以0.01和0.1 MOI接种VERO DS细胞，每隔12h测定病毒滴度，连续培养168h，绘制病毒生长曲线，分析生长特性。结果显示，病料接种细胞72h后，出现细胞病变，经RT-PCR和间接免疫荧光试验鉴定为小反刍兽疫病毒；生长特性研究显示，0.01和0.1 MOI两种病毒接种量，病毒滴度最高均为106 TCID50左右，但峰值出现时间和下降速度存在差异，0.01 MOI接种量出现峰值晚，但是维持高滴度时间较长。本文成功分离一株小反刍兽疫病毒，并对两种接毒量的生长特性差异进行了初步分析，为探索该病毒培养方法和收毒时间提供了借鉴。
小反刍兽疫（peste des petits ruminants，PPR）又称小反刍兽假性牛瘟、肺肠炎、口炎肺肠炎综合征等，是由小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus，PPRV）引起，临床以发热、口炎、腹泻和肺炎为主要特征的绵羊和山羊的一种急性、高度接触性传染病，发病率和死亡率最高可分别达到100%和90%[1，2]。世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病，是《国家中长期动物疫病防治规划（2012—2020年）》重点防控的13种外来动物疫病之一。该病于1942年在非洲西部的象牙海岸科特迪瓦首次暴发，2007年[3]和2013年先后传入我国西藏和新疆部分地区，并在其他多地出现PPR疫情。
PPRV与牛瘟病毒（RPV），犬瘟热病毒（CDV）、海豹瘟病毒（PDV）、海豚瘟病毒（DDV）、牛麻疹病毒（MV—K1）和人麻疹病毒（MV）等同为副粘病毒科（Paramyxoviridae）麻疹病毒属（Morbolivirus）成员[4]。基因组为单股负链、无节段RNA[5]。其RNA链从3'到5'端依次为编码N-P-M-F-H-L蛋白的基因[5]。目前该病毒仅有一个血清型，从遗传演化上，根据F基因分析可分为四个族系，IV系主要分布在中东和西亚，我国发生的PPR疫情也为IV系[3，6]。
本研究将患病羊的组织病料接种VERO DS细胞，分离出一株PPRV，经RT-PCR和间接免疫荧光实验确认后，对0.1和0.01 MOI病毒接种量的生长特性进行了研究，结果表明不同接种剂量条件下，病毒具有不同的增殖曲线。本研究对于如何分离PPRV具有一定实践意义，此外，还揭示了用VERO DS细胞进行病毒增殖时，接毒剂量与增殖、病毒活力之间的关系，为PPRV的培养提供了参考。
1、材料与方法
1.1主要仪器和试剂
Hettich MIKRO 220R低温台式离心机；Olympus倒置荧光显微镜；Heraeus CO2培养箱；杭州博日Gene Max PCR仪；Count Star细胞计数仪；DMEM购自life公司；胎牛血清购自Hyclone公司；VERO DS细胞为本实验室保存；High pure viral RNA kit购自ROCHE公司；PPRV特异性单克隆抗体和VERO DS细胞为本实验室保存；PPRV常规RT-PCR检测方法为本实验室建立。
1.2 VERO DS细胞的准备
取生长状态良好的VERO DS细胞进行常规传代，待细胞覆盖细胞瓶底70%时，PBS洗2次，备用。
1.3病料采集与处理
采集发病期间死亡羊的脾脏，充分剪碎后加入10倍量的Hank's液，研磨器中研磨成乳剂，以3 000 r/min离心沉淀10 min后取上清液，0.2μm孔过滤除菌，备用。
1.4病料接种
将处理好的病料上清液按培养液体积的1/10接种VERO DS细胞系，置37℃培养箱内吸附，1h后弃去上清，PBS洗2次，加入含2%胎牛血清的DMEM维持液，于37℃5%CO2培养箱培养，同时设未接病料对照，每天观察细胞病变情况。
1.5病毒鉴定
1.5.1 RT-PCR检测细胞出现病变后，连续传三代，取第三代病毒液200µL，用ROCHE公司High pure viral RNA kit提取病毒RNA，并用PPRV特异性检测引物进行RT-PCR扩增。
1.5.2免疫荧光检测将病毒接种于长满单层VERO DS细胞的96孔板，置5%CO2培养箱37℃培养，待病变达60%～70%时，吸净培养液，用PBS洗涤一次，加入95%的甲醇固定10min。弃掉固定液，敞开培养板使其自然干燥。加0.5%Triton室温作用15 min。用PBS将PPRV特异性单克隆抗体1:2 000稀释后加入培养板，40μL/孔，37℃振摇孵育1 h。PBST洗涤三次，每孔加入40μL 1:100稀释的FITC标记山羊抗鼠IgG，37℃振摇孵育1 h，PBST洗涤三次，加90%甘油50μL。荧光倒置显微镜下观察。
1.5.3生长曲线测定测定第三代病毒液TCID50，用细胞计数仪测定细胞浓度，分别以0.01 MOI和0.1 MOI[7]接种VERO DS细胞各14瓶，每隔12h取出1瓶-70℃冻存，用于检测病毒滴度，连续培养7天。分别测定14瓶细胞的TCID50，绘制病毒生长曲线。
2、结果与分析
2.1病毒分离与CPE观察结果
镜下观察发现，接毒后第3天可见细胞发生融合，形成多个大小不等的合胞体（图1）。第4天，病变细胞呈现拉网状，继之出现大片脱落（图2）。连续传至第3代，每代可见相同的CPE。将该分离毒命名为PPRV-S。
2.2病毒的RT-PCR鉴定
用PPRV特异性引物进行RT-PCR扩增，结果显示，在300bp左右出现特异性条带，大小与预期相符，将扩增产物送交生工测序，核酸片段为PPRV特异性核酸片段（图3）。
2.3免疫荧光检测结果
间接免疫荧光检测显示，在接种PPRV-S分离毒的细胞孔发现绿色荧光，阴性对照孔未发现绿色荧光（图4），表明该分离毒可被PPRV特异性单克隆抗体识别。
图1细胞融合形成合胞体
图2细胞病变脱落呈拉网状
图3 PPRV的RT-PCR鉴定结果
图4免疫荧光检测（400×）
2.4 TCID50检测结果
不同接毒时间TCID50的检测结果显示，病毒接种细胞后病毒滴度首先出现一定程度下降，在12-24h病毒滴度最低，之后开始快速升高，36-60h达到峰值，两种病毒接种量的最高TCID50为接近106TCID50/mL，之后缓慢下降。接毒168h后，病毒滴度仍能达到103-104TCID50/mL（图5）。
不同病毒接种量TCID50检测结果显示，0.1 MOI接种量在接种后36h即可达到病毒滴度峰值，0.01 MOI接种量则在60h病毒滴度峰值。就出现后的下降速度而言，0.1 MOI接种量出现峰值后滴度迅速下降，84h后病毒滴度降低至104TCID50/mL以下，而0.01 MOI接种量出现峰值虽然较晚，但直至接毒132 h后病毒滴度才下降至104TCID50/mL以下；两者在接毒168h后，病毒滴度基本相同，为103.5TCID50/mL左右（图5）。
图5 PPRV-S的TCID50变化曲线
3、讨论
PPRV是一种有囊膜的单股RNA病毒，在2007年首次传入我国西藏，时隔6年又传入我国新疆地区。据OIE网站提供资料，除新疆外，该病2014年在我国多个省、市、自治区相继发生，防控形势极为严峻。多角度研究PPRV相关特性，为PPR防控提供技术支持很有意义。
目前用于分离病毒的细胞为VERO细胞系和VERO DS细胞系。研究发现，病毒在感染细胞的过程中，SLAM蛋白是介导病毒进入细胞的主要受体，促使病毒囊膜与细胞膜发生融合，进而使病毒粒子进入细胞内部[8]。VERO DS细胞系因在细胞表面存在犬SLAM受体，提高了病毒的分离效率，因此理论上说，VERO DS细胞系比VERO细胞系更适合用于PPRV分离，但是由于羊和犬的SLAM蛋白同源性不到70%，所以VERO DS细胞系仍不是用于PPRV分离的最佳细胞。由于本实验室没有细胞表面存在的羊SLAM蛋白的细胞系，所以用VERO DS细胞进行PPRV分离。
由于PPRV对环境的抵抗力非常弱，50℃60分钟即可被灭活，阳光照射也容易将病毒灭活[7，9]。现实工作中，从对发病羊采集样品到运送至实验室进行病毒分离往往需要几天甚至更长时间，这时的样品虽然用RT-PCR仍能检测出高含量的病毒核酸，但病毒往往已经不具有感染性，不适合进行病毒分离。因此，一旦确定采样的目的是分离病毒，需要在采集样品后及时冷冻保存并尽快送至实验室进行病毒分离，避免反复冻融和在室温下放置太长时间。此外，运输过程中也要保持低温。同时，还需要尽量选择病毒含量高的组织样品用于病毒分离，以提高分离效率。但需要注意的是，由于肠组织中含有大量的酶类成份，容易对细胞产生影响，不太适合用于病毒分离。
本研究除分离到一株PPRV外，还绘制了分离毒的生长曲线。通过对接毒后168h的观察发现，病毒接种后24h内，病毒滴度出现下降，可能由于病毒粒子进入细胞内，但还未产生具有感染性的新的病毒。24h至36h是病毒的对数繁殖期，这一时期有大量的新病毒被释放出来，之后病毒滴度开始出现缓慢降低或维持一定水平。本文采用了两个病毒接毒剂量，0.1MOI和0.01MOI，其中0.1MOI孔出现病毒滴度峰值的时间明显早于0.01MOI组，但之后迅速下降。而0.01MOI组虽然出现峰值的时间明显晚于0.1MOI组，但却略高于0.1MOI组，而且能够在较高的滴度维持较长的时间。两种接毒剂量在168h均有一定的感染力。这一研究对于PPR疫苗研究和生产过程中何时收获病毒液有一定借鉴意义。由于目前我国使用的PPR疫苗为弱毒疫苗，因此如何保证生产过程中活毒效价非常重要。考虑到实际生产过程中无法对每个批次进行不同时间点的TCID50测定，作者建议采用能使病毒在高滴度维持较长时间的0.01MOI接种剂量。需要说明的是，本文只研究了PPRV在VERO DS细胞系上的生长曲线，如果了解在VERO细胞上的生长特性，还需要另外进行相关研究。