呼宁散对鸡肺源大肠杆菌生长曲线、细胞壁的影响及抑制效果——讨论、结论
3讨论
鸡呼吸道疾病综合征的病原体复杂多样，大肠杆菌是该病最常见的细菌性病原体之一。鸡大肠杆菌感染在中兽医上属湿热证，其感染所致的鸡呼吸道疾病综合征在中兽医被归类于“上感”症状的范畴，治疗时应着重于泻肺平喘、恢复肺气的畅达与宣降、消炎抑菌、清热解毒及增强免疫力等。因此，本试验在该病的中兽医病因分析基础上，根据“辨证施治”基本原则，筛选出桑白皮、黄芩、蒲公英、甘草等10味中草药，按照“君臣佐使”配伍原则进行了合理组方。便携的中药剂型在当前中兽药市场更受消费者青睐，本研究将方中药材依次进行浸泡、煎煮得到汤剂，再通过浓缩、冻干、粉碎后得到呼宁散，在不改变药效的前提下，改变了汤剂的物理性状，可延长中药的保质期，且方便携带、保存和使用。
抑菌试验结果是抗菌药物最基本的药效学数据，常用的方法有纸片扩散法、牛津杯法、二倍稀释法及TTC法等。在抑菌试验中MIC和MBC是重要指标，能抑制试验菌生长的最低药物稀释度为该药的MIC，能够杀灭试验菌的最低药物稀释度为该药的MBC。同时细菌生长情况可以通过绘制生长曲线进行了解。高瑞芳等通过测定细菌生长曲线检测到香青兰提取物对大肠杆菌具有抑菌活性。本试验选用的牛津杯法结果显示鸡肺源大肠杆菌对呼宁散中度敏感，TTC法测得呼宁散对鸡肺源大肠杆菌的MIC为250 mg·mL-1，MBC为500 mg·mL-1，且细菌生长曲线结果也显示呼宁散在0~24 h内均可抑制该菌株的生长，表明呼宁散对鸡肺源大肠杆菌具有显著的抑制效果。
细菌的细胞膜和细胞壁之间存在AKP，当细胞壁受到破坏后，AKP会由胞内泄漏到胞外，可以通过检测胞外AKP含量(或活性)以确定细胞壁的完整性。正常情况下蛋白质、核酸等大分子无法通过细胞膜屏障，当细胞膜通透性受到破坏时，胞内物质外溢会导致胞外蛋白、核酸浓度升高，不利于细菌成长。刘琳等通过电导率检测仪检测到石榴皮水提物作用于大肠杆菌3 h后，菌液中AKP含量显著增加，表明石榴皮水提物能破坏大肠杆菌细胞壁。Wang等采用酶标仪检测大肠杆菌核酸的外渗水平，结果显示细菌紫外吸收率显著增加，证明野胡麻破坏了大肠杆菌的细胞膜完整性。本试验通过检测鸡肺源大肠杆菌培养液中AKP活性、可溶性蛋白及核酸含量，结果发现呼宁散作用于细菌12 h时，1/2 MIC组和MIC组培养液中AKP、可溶性蛋白及核酸含量均显著增加，表明呼宁散可破坏鸡肺源大肠杆菌的细胞壁和细胞膜而发挥抑菌作用。
LPS是革兰阴性细菌细胞壁的主要成分，也是病原菌最为重要的模式分子，可诱导严重的炎症反应，激活细胞产生多种炎症因子，从而引起一系列的病变，常用来代替大肠杆菌诱导炎症动物或细胞模型。DF-1细胞为可传代的鸡成纤维细胞系常用以研究禽类病原体对细胞的损伤，因此本试验选取LPS诱导的DF-1细胞模型来探究呼宁散的体外抗炎和抗氧化作用。CCK-8溶液中的WST-8在电子耦合试剂存在时，可被细胞中的脱氢酶还原为黄色，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系，因此本试验利用这一特性进行细胞增殖和细胞毒性测定，确定了呼宁散低、中、高剂量组的给药浓度分别为1.5、2、2.5 mg·mL-1，LPS诱导DF-1细胞损伤的建模浓度为40 mg·mL-1，为后续体外试验奠定了基础。
TLR4/NF-κB信号通路在炎症反应过程中起着关键性作用。LPS与TLR4配体结合激活NF-κB信号通路，导致细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等分泌，引起机体炎症反应。IL-1β大量产生于炎症初期，促进炎症反应。IL-6是促炎因子，能与靶细胞表面IL-6受体结合成复合物，调控炎症细胞因子的表达。IL-8也是常见的促炎因子，参与炎症感染时各种细胞的相互作用。大量研究表明，中药能够通过抑制TLR4/NF-κB通路中的炎症因子从而缓解炎症状态。本试验通过ELISA法测定细胞培养上清中IL-1β、IL-6和IL-8的含量，进一步地通过Western blot法测定TLR4/NF-κB通路关键蛋白TLR4、NF-κB p65的表达量，结果证实呼宁散可通过调控TLR4/NF-κB信号通路来抑制炎症因子的过度分泌，从而减轻LPS诱导的DF-1细胞炎症反应。
体内感染通常会产生大量的超氧阴离子，氧化应激与炎症反应关系密切。氧化应激是指细胞内氧化和抗氧化系统的失衡，导致平衡倾向于过氧化状态。研究表明，LPS可通过激活促炎细胞因子产生大量的ROS，进而导致细胞出现氧化应激。当ROS过量时，多余的ROS会攻击体内组织，导致细胞的损伤和衰老。MDA是膜脂过氧化重要的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤，是评价氧化应激的重要指标。SOD是机体内天然自由基消除剂，能催化机体内超氧自由基发生歧化反应，是检测抗氧化能力的指标之一。GSH是体内重要的抗氧化剂，可以将有毒物质转化为无害物质，排泄出体外，反映了组织抵抗氧化损伤的能力。Wang等研究表明，LPS可通过诱导氧化应激引起鸡肝脏细胞变性和坏死，增加体内ROS和MDA的产生，进而导致肝脏发生氧化损伤。本试验通过相关试剂盒检测ROS、MDA、SOD、GSH含量，结果发现呼宁散可降低DF-1细胞中氧化应激标志物ROS和MDA的含量，提高抗氧化物SOD和GSH的水平。Keap1/Nrf2通路是抵御氧化应激的主要防御机制，Nrf2是一种关键转录因子，能够通过调控下游抗氧化基因的转录诱导抗氧化酶的生成，从而调节细胞或机体的抗氧化能力。正常情况下Nrf2与Keap1相结合，氧化应激状态下Nrf2与Keap1解离而活化，进一步激活下游抗氧化基因和细胞保护基因的表达，主要包括HO-1、NQO1、GSH等。本试验进一步通过Western blot法测定了Keap1/Nrf2信号通路关键蛋白Keap1、Nrf2、NQO1、HO-1表达量，结果发现呼宁散可明显降低Keap1蛋白表达量，上调Nrf2、NQO1、HO-1蛋白表达量，表明呼宁散可通过调控Keap1/Nrf2信号通路提高DF-1细胞的抗氧化能力，从而有效缓解LPS所致的氧化损伤。
4结论
呼宁散对鸡肺源大肠杆菌具有良好的抑菌活性，并且可通过调控LPS诱导的DF-1细胞TLR4/NF-κB、Keap1/Nrf2信号通路发挥抗炎、抗氧化能力，为临床用于防治鸡肺源大肠杆菌及鸡呼吸道疾病综合征药物的研发提供理论依据。
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