辣木籽提取物制备、对蜡样芽孢杆菌的抑制作用及在在液态乳中的应用（三）
2.2响应面试验结果
采用Design Expert 8.0.7.1软件对表4中的数据进行多元回归拟合，可以得到辣木籽提取物抑制蜡样芽胞杆菌的抑菌圈（Y）对各个因素变量的二次方程为：Y=26.79+0.56A−0.28B+0.27C+0.85D−0.27AB+0.74AC−0.052AD+0.36BC+0.41BD+0.93CD−2.89A2−0.082B2−0.91C2−0.91D2。对回归方程进行方差分析，结果见表5。
表4响应面试验设计与结果
由表5可知，模型的P＜0.05，说明试验模型具有显著性，失拟项F=3.01，失拟不显著，失拟项P=0.15＞0.05，表明该方程拟合度较好。模型系数R2=0.7688，说明模型能解释76.88%的响应值变化。由F值可知，显著性次序为：温度（D）＞pH（A）＞料液比（B）＞浸提时间（C）。
表5回归方程方差分析结果
应用Design Expert 8.0.7.1软件绘制出响应面图，通过图2分析响应面4个因素交互作用对辣木籽抑菌成分提取的影响，时间和温度的交互作用相较于其它因素间交互作用更加显著，其次是pH和时间，而pH和温度的交互作用最不显著。
图2不同提取条件的交互作用
根据Design Expert 8.0.6软件分析，得出最佳提取条件为：pH3.16，料液比1:70 g/mL，浸提时间2.46 h，浸提温度50℃，预测其抑菌圈大小为27.52 mm，考虑到实际操作的方便，条件调整为pH3.1，料液比1:70 g/mL，浸提时间2.5 h，温度50℃，验证试验重复3次，得到的实际抑菌圈大小为（27.23±0.58）mm。试验结果表明，该模型能较好的预测辣木籽抑菌成分提取条件，该工艺优化可靠。
2.3最小抑菌浓度和最小杀菌浓度
最小抑菌浓度和最小杀菌浓度结果如表6所示，随着辣木籽提取物浓度的升高，其抑菌活性逐步增强，对ST-1351和ST-1349菌株的MIC为1.25 mg/mL，对ST-1350菌株的MIC为2.5 mg/mL，对ST-1351菌株的MBC为2.5 mg/mL，对ST-1350和ST-1349菌株的MBC为5 mg/mL。
表6最小抑菌浓度和最小杀菌浓度
2.4辣木籽提取物的稳定性研究结果
2.4.1 pH对辣木籽提取物抑菌活性的影响由图3可以看出，辣木籽提取物有良好的酸碱稳定性，其结果表明，酸碱环境不会破坏辣木籽提取物的抑菌成分活性，即辣木籽提取物对酸碱环境有一定耐受性，能在酸碱处理后仍保持稳定的抑菌活性。
图3 pH对辣木籽提取物抑菌稳定性的影响
2.4.2温度对辣木籽提取物抑菌活性的影响以不经过高温处理的辣木籽提取物对蜡样芽孢杆菌的抑菌圈为空白对照，通过图4可以看出，在70℃条件下处理30 min后其抑菌效果有显著降低，其抑菌活性为空白组的92.15%，而当100℃处理30 min后，其抑菌活性为空白组的50.97%。试验结果表明，温度对辣木籽提取物的抑菌活性影响显著（P＜0.05）。
2.4.3紫外线照射对辣木籽提取物抑菌活性的影响图5显示，辣木籽提取物经20 W紫外线照射处理20～80 min后，与未经处理组的抑菌活性无明显差异，其结果表明，辣木籽提取物能很好的抵御紫外线的破坏，保证在自然条件下的抑菌活性。
图5紫外线照射时间对辣木籽提取物抑菌稳定性的影响
2.5辣木籽提取物在全脂乳和脱脂乳中的应用
2.5.1辣木籽提取物对乳中细菌增长的影响图6表明，分别以不添加辣木籽提取物和蜡样芽胞杆菌的全脂乳和脱脂乳为空白对照，以添加B.cereus的全脂乳和脱脂乳为阴性对照，发现在4℃条件下，添加MIC和1/2 MIC的辣木籽提取物可以明显抑制蜡样芽抱杆菌在乳中的生长，添加MIC辣木籽提取物的全脂乳在第2 d菌落数为0，脱脂乳在第4 d菌落数为0，添加1/2 MIC的乳在第8 d菌落数为0。已有研究证明低温条件本身会抑制乳中微生物的生长，而辣木籽提取物的添加则完全抑制了乳中蜡样芽胞杆菌的生长，猜测低温和辣木籽提取物具有协同作用，能共同抑制蜡样芽胞杆菌的生长，延长乳保质期。
图6添加辣木籽提取物对乳贮藏过程中蜡样芽孢杆菌数量的影响
2.5.2辣木籽提取物对乳色度的影响测定乳L*、a*、b*值，其中+a*表示红度，−a*表示绿度；+b*表示黄度，−b*表示蓝度，乳的明亮度（L*）取决于所含胶体粒子（乳脂球、磷酸钙、酪蛋白胶束）的光散射，绿度（−a*）是由一种强光敏剂——核糖核酸酶（RiboflAvin）引起，而黄度（+b*）的变化则由某些微生物的繁殖直接造成。如表7所示，与空白组比较，添加辣木籽提取物对脱脂乳和全脂乳色度无显著影响（P＞0.05），并能在贮藏7 d和14 d显著减缓脱脂乳和全脂乳L*的降低和a*、b*的升高，空白组结果与Paul-Sadhu对巴氏杀菌乳的研究结果相符，且与乳中菌落数变化趋势一致，证明乳中菌落的繁殖对乳色度存在影响，辣木籽提取物的添加能显著减缓贮藏过程中乳色度变化。
表7 4℃条件下液态乳不同贮存时间的色度变化
2.5.3辣木籽提取物对乳黏度的影响表8看出，以脱脂乳和全脂乳为空白对照，添加辣木籽提取物对乳黏度无显著影响（P＞0.05），在贮藏过程中，空白组和B.cereus组黏度均呈显著上升趋势（P＜0.05），添加MIC辣木籽提取物的乳黏度在7 d和14d与空白组无显著差异，添加1/2 MIC辣木籽提取物的乳黏度升高较空白组缓慢，这与乳中菌落数生长呈正相关。分析原因可能是由于巴氏杀菌乳本身并非完全灭菌，所以乳中仍存在少量微生物及其蛋白酶、脂肪酶，在贮藏过程中导致乳中成分被分解破坏，胶束稳定性有衰减，部分胶束絮凝，从而黏度升高，而辣木籽提取物对乳中微生物或酶存在抑制作用，使乳成分保持稳定，黏度衰减变缓。
表8 4℃条件下脱脂乳和全脂乳不同贮存时间黏度变化
2.5.4辣木籽提取物对乳风味的影响通过PEN3传感器系统，发现W1C、W3C、W6S、W5C、W2W五种传感器的响应值值发生变化，分别对应芳香类、氨类、氢化物、烷烃、有机硫化物5种挥发性风味物质。在脱脂乳中，PC1和PC2的方差贡献率分别为75.58%和19.39%，两个主成分累计贡献率达94.97%。全脂乳中PC1和PC2的方差贡献率分别为65.47%和25.05%，两个主成分累计贡献率达90.52%。脱脂乳和全脂乳PCA分析分别如图7、图8所示，加入辣木籽提取物对乳挥发性风味影响不显著（P＞0.05），同时能在贮藏过程中显著减少脱脂乳和全脂乳中芳香类、氨类、氢化物和烷烃类气味成分的产生。这可能是蜡样芽孢杆菌和其他杂菌在贮藏过程中繁殖，分解乳中蛋白质和脂肪，使乳中风味发生变化，而辣木籽提取物的添加能抑制蜡样芽孢杆菌和其他杂菌的生长，从而显著减少乳风味的变化。
图7 4℃条件下脱脂乳不同贮存时间的风味PCA分析图
图8 4℃条件下全脂乳不同贮存时间的风味PCA分析图
2.5.5辣木籽对乳感官影响通过20人感官评分结果如图9所示，添加辣木籽提取物对乳滋味、气味、色泽、组织状态和煮沸状态无显著影响（P＞0.05），在贮藏7 d后，空白组脱脂乳和全脂乳颜色变黄，出现明显絮状物，煮沸后凝固，而添加了MIC辣木籽提取物的组在7 d后变质性状不显著，无沉淀和絮凝出现。结果表明辣木籽提取物的添加不仅能减少乳的腐败，还能减缓其感官品质变化。
图9添加或不添加辣木籽提取物的脱脂乳和全脂乳感官评分图
3结论
研究表明：辣木籽抑制蜡样芽胞杆菌成分的最佳提取条件是以水为溶剂，在pH3.1，料液比1:70，浸提温度50℃，浸提时间2.5 h工艺条件下，得到其抑菌圈大小为（27.23±0.58）mm。抑菌稳定性试验表明，辣木籽提取物的抑菌活性对pH和紫外线照射稳定（P＞0.05），100℃处理30 min后辣木籽提取物活性为空白组的50.97%。将辣木籽提取物应用于脱脂乳和全脂乳中，发现14 d内可明显抑制巴氏杀菌乳色度、黏度和风味变化，且巴氏杀菌乳的色度、黏度和风味与乳中菌落数的增长具有明显相关性。证明了辣木籽水提物在液态乳贮藏中具有抑菌保鲜潜力，但目前辣木籽水提物的抑菌研究较少，其机理有待在本研究基础上进一步探讨，以便更好地为后续辣木籽水提物在液态乳中的实际应用提供理论依据。