基于体外重组鸡传染性贫血病毒生长曲线来研究复制效率（三）
3讨论
自1979年日本学者Yuasa等首次在日本分离到CIAV（Gifu-1株）以来，CIAV在世界范围内呈现快速蔓延趋势，在全球多地区分布。我国于1992年首次于黑龙江报道该病并分离到该病毒。随后，辽宁、江苏、山东、广东、广西、安徽、江西以及台湾等地也陆续报道了该病的流行。目前，CIAV在全国各省市、自治区流行态势严峻，防控压力日益增大。CIAV主要引起雏鸡的再生障碍性贫血和全身性淋巴组织萎缩，成年鸡感染CIAV后常呈亚临床带毒，生产性能以及免疫功能下降，增加对其他病原（如病毒、细菌、真菌）的易感性。CIAV感染往往可降低疫苗的免疫效果和增强弱毒活疫苗的致病力，从而造成免疫失败。
同时，CIAV与其他一些病毒性疾病如J亚群禽白血病病毒（ALV-J）、马立克病病毒（MDV）和FAdV-4等混合感染时会加重鸡群疫病，引起更为严重的免疫抑制和更高的死亡率。此外，有研究报道，可能是接种污染了CIA的弱毒活疫苗，低致病性CIAV在国内SPF鸡群中同样存在。现阶段，虽然CIA商品化弱毒活疫苗在种鸡中使用较广泛，如法国诗华动物保健公司生产的CIRCOMUNE®，默沙东公司生产的Nobilis®CAV P4，德国罗曼动物保健品公司以Cux-1毒株生产的弱毒活疫苗以及维奥（BIOVAC）生产的Gyrovac。但CIAV感染及其与其他病原的共感染在国内鸡群仍呈普遍性，很大程度上制约了国内养鸡业的健康持续发展。值得注意的是，CIA商品化弱毒活疫苗仅适用于种鸡或6周龄以上鸡的免疫，对2周龄以下雏鸡存在潜在的感染风险。雏鸡感染CIAV弱毒后可导致免疫抑制，对其他疫苗造成免疫失败。
此外，Fang等研究表明CpG ODN佐剂比Freund佐剂能更好地诱导CIAV特异性抗体反应，是未来CIA亚单位疫苗佐剂的候选。Shen等研究表明重组病毒蛋白（rVP1）+鸽γ干扰素（rPiIFN-γ）疫苗可能是一种新的预防CIA的疫苗。
Tseng等证明杆状病毒表达系统产生的自组装病毒样颗粒（VLP）同样有可能成为一种安全有效的CIA疫苗。关于DNA疫苗，有研究报道通过使用表达CIAV的VP1和VP2蛋白的双顺反子载体来制备CIA DNA疫苗，CIAV的VP1蛋白与血清1型MDV的VP22蛋白融合可以提高CIA DNA疫苗的效力，大肠杆菌表达截短的高迁移率族框1（HMGB1）蛋白作为新型免疫佐剂可诱导CIAV保护性免疫应答。但上述CIA亚单位疫苗和DNA疫苗皆无商品化应用的报道。因此，创制新型CIA疫苗对高效免疫防控CIAV感染及其他病毒病至关重要。
近年来，国内鸡群除了CIAV感染具有普遍性外，FAdV感染的报道也逐年增多。其中，以高致病性FAdV-4导致的肝炎-心包积液综合征在鸡群最为流行，对国内养鸡业造成了巨大经济损失。本课题组前期在探究FAdV-4的Fiber蛋白介导的病毒感染与致病中发现，Fiber-1直接介导FAdV-4感染，而Fiber-2为FAdV-4的重要致病因子。
进一步利用CRISPR-Cas9基因编辑技术发现Fiber-2不仅具有可编辑性，而且构建的EGFP-Fiber-2融合，EGFP代替Fiber-2以及Fiber-2部分缺失的重组FAdV-4病毒能作为致弱的基因工程FAdV-4候选疫苗。
本研究整合CRISPR-Cas9和Cre-LoxP系统，以EGFP-Fiber-2融合的重组病毒FA4-EGFP为模板，将CIAV的保护性抗原基因VP1替换FAdV-4中的fiber-2基因，拯救出了表达CIAV的VP1蛋白的新型重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1。在该系统中，通过观察RPF，可以直观地在LMH细胞中发现含有外源基因的重组FAdV-4，与所使用的表达EGFP的模板病毒FA4-EGFP所区分。
通过有限稀释和病毒空斑试验，重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1-RFP可以得到快速纯化。通过转染Cre重组酶进一步去除重组FAdV-4-CIAV-VP1-RFP中的RFP表达盒，能够非常高效地获得重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1。虽然重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1可有效表达CIAV的VP1蛋白，但其在易感细胞LMH中的复制能力要显著低于野生型FAdV-4。此外，文献报道单独的VP1蛋白并不能对鸡提供有效保护。因此，构建的重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1是否对鸡高度致弱，是否可通过有效表达的VP1蛋白免疫防控CIAV或同时防控CIAV与FAdV-4尚需进一步通过动物试验进行评估。
4结论
本研究成功构建可有效表达VP1蛋白的新型重组病毒rFAdV-4-CIAV-VP1，在易感细胞LMH中的复制能力显著低于野生型FAdV-4，为有效防控CIAV和FAdV-4感染提供新思路。
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