转录水平解析昆虫病原线虫共生菌菌株新型杀菌蛋白PPIA-L20基因表达调控——结果与分析
2 结果与分析
2.1 不同发酵时间ppia-l20基因的表达变化
分别取4～84 h不同发酵时间点的NN6菌株的菌体细胞，提取Total RNA进行6次实时荧光定量PCR测定，结果(图1)表明ppia-l20相对表达水平极不稳定且趋势多样，即使是使用同一内参基因16S rRNA。选取16S rRNA和ropB两种内参基因，共同定量得到相似基因表达趋势的8和12 h 2个时间点的菌株进行后续的转录组测序(图1-F)。
图1 不同发酵时间ppia-l20基因的表达水平
2.2 Xenorhabdus bovienii NN6发酵时间与菌体总数、活菌数、基因相对表达水平相关性分析
从图2可知，随着发酵时间的延长，菌体量逐渐增加。从表3可见，对数期活菌数与菌体总数(D600表示)与发酵时间成正相关，说明随着发酵时间的延长，对数期的菌体大量繁殖，但与ppia-l20基因表达水平无相关性。
图2 发酵过程中菌体量变化
表3 对数期活菌数、菌体总数、ppia-l20基因相对表达情况相关性分析
2.3 RNA-Seq测序数据质量分析
对8和12 h 2组不同发酵时间菌体细胞共6个样本进行高通量测序，并对测序质量进行统计分析。结果(表4)显示:原始测序序列(raw reads)去除带接头序列、空序列及低质量测序序列后分别得到15 352 102、14 498 440、18 087 468、15 466 120、15 821 766、16 257 026条纯净序列(clean reads)，碱基GC含量平均为48.86%，低质量碱基测序序列(<Q20)占原始序列的比例很低，而高质量碱基序列(≥Q20)平均比例达到98.18%，说明测序数据的碱基组成情况和质量良好。将过滤后的测序序列比对到参考基因组上，发现测序序列均匀覆盖在参考基因组上，能定位到基因组上测序序列的平均比例达87.89%。这些结果表明此次测序序列的整体质量良好，测序数据随机性良好，可用于后续的分析。
表4 测序数据质量统计
2.4 Xenorhabdus bovienii NN6两组间差异表达基因(DEG)分析
以发酵8 h菌体中的基因表达水平为参照，利用DESeq2(V1.6.3)分析发酵12 h菌体中差异表达的基因，设置筛选阈值 P<0.05，log2(Fold change)>1，构建火山图(图3-A)。RNA-seq共检测到2 716个基因，其中466个DEG，基因组占比17.2%，其中193个DEG上调，273个DEG下调。DEG的热图聚类分析表明重复组内基因表达趋势基本相同，组间差异显著(图3-B)。
图3 Xenorhabdus bovienii NN6两组间差异表达基因
2.5 RT-qPCR验证转录组数据
随机选取8个DEG(包括4个上调基因和4个下调基因)和2个表达差异不显著的基因，Real-time PCR验证结果(图4)显示基因表达趋势与测序数据结果一致，说明RNA-seq转录组测序结果数据可靠。
图4 RNA-seq数据与RT-qPCR比对
2.6 Xenorhabdus bovienii NN6两组间GO富集分析
进一步对8和12 h 2组中的DEG进行GO注释分析，结果(图5)显示有442个DEG注释到生物学过程、细胞组分和分子功能大类的31个功能小类中。分子功能分类中含有最多的差异基因，分子功能中差异基因主要归属于杂环化合物结合、转录调节因子活性、氮化合物代谢和转移酶活性等。生物学功能和细胞组分分类中的差异基因数量少于分子功能分类，生物学过程中差异基因主要富集在代谢过程和应激反应。值得注意的是，细胞组分分类中仅富集到2个功能小类，主要归属于细胞和膜部分，与细胞膜的功能相关。这表明Xenorhabdus bovienii NN6菌株可能在发酵过程中代谢活跃，ppia-l20表达量变化可能与转移酶活性和膜蛋白转运过程有关。
为了探究DEG在ppia-l20基因表达变化中的潜在功能，对所有DEG进行GO富集分析，分别统计生物过程(BP)、细胞成分(CC)和分子功能(MF)3个分类富集程度前10的GO条目，图6结果表明在这30个GO条目中，差异表达基因在生物过程中主要富集于细胞膜(membrane)、定位(localization)、水解酶(hydrolase activity)、膜整体成分(integral component of membrane)、膜内成分(intrinsic component of membrane)、转运活性(transporter activity)。其中细胞膜(membrane)的富集率最高为77.5%，表明在发酵过程中Xenorhabdus bovienii NN6菌株与膜相关GO条目中的77.5%的基因差异表达，提示发酵过程中ppia-l20基因表达升高可能与细胞膜功能相关蛋白的表达密切相关。
图5 Xenorhabdus bovienii NN6两组间差异表达基因的GO注释分类图
图6 Xenorhabdus bovienii NN6组间差异表达基因各分类前10的GO富集分析
2.7 Xenorhabdus bovienii NN6两组间DEG的KEGG富集分析
KEGG注释结果(图7)显示，有191个DEG注释到了62个KEGG代谢通路。基于KEGG数据库(https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)进行通路分析，其中13条通路的可信度显著(P<0.05)。上调基因主要富集在次级代谢产物合成、氨基酸合成、双组分调节系统相关通路; 下调基因主要富集在次级代谢产物合成相关通路、鞭毛组装与磷酸转移酶系统相关通路。
图7 Xenorhabdus bovienii NN6差异表达基因前20的KEGG富集分析
2.8 KEGG关键通路中代表性DEG分析
从表5可知，参与双组分调节系统共有14个DEG，其中12个表达上调2个表达下调。ompR基因编码的转录调控蛋白OmpR是双组分调节系统的关键蛋白，qseC基因编码双组分传感器激酶N端结构。目的基因ppia-l20位于阳离子抗菌肽抵制通路中，位于同一条通路上的3个基因中，arnF和eamA编码的蛋白属于DUF6转录因子家族，其表达上调，另一个基因nlpE负责编码外膜脂蛋白，参与铜离子的摄取和黏附功能，其表达下调。
表5 关键通路中代表性差异基因表达情况
2.9 PPIA-L20相关蛋白互作网络分析
通过STRING对PPIA-L20蛋白进行蛋白互作网络构建，以获取其潜在蛋白的互作关系，如图8所示，PPIA-L20可能与AMPs结合蛋白TycC、GrsB、ATP酶HtpG、酮酰合成酶N端PpsE蛋白等蛋白相互作用，AMPs结合蛋白TycC、GrsB定位于细胞外膜，用于识别外界AMPs结合信号，ATP酶HtpG和酮酰合成酶N端PpsE蛋白参与细胞的能量代谢过程。
GO富集分析表明，ppia-l20基因变化与细胞膜的变化、转移酶活性、代谢过程相关，KEGG通路分析预测，PPIA-L20蛋白位于阳离子抗菌肽抵抗通路，与双组分调节系统、磷酸转移酶系统活动相关; 与PPIA-L20蛋白位于共同通路(阳离子抗菌肽抵抗通路)的nlpE基因表达的外膜脂蛋白NlpE属于DUF6转录因子家族，NlpE蛋白与双组分调节系统中的cpxR基因、cpxA基因表达的蛋白具有互作关系。在肠杆菌科中，控制AMPs耐药性的基因通常受双组分信号通路以及磷酸转移系统的控制，NlpE蛋白同时存在于PPIA-L20蛋白共同通路(阳离子抗菌肽抵抗通路)的上游，可能起到调控ppia-l20基因表达的作用，该蛋白相互作用网络的构建为调控机制的推测提供线索。
图8 蛋白互作的网络预测
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