生食大眼金枪鱼中生物胺产生菌分离纯化、菌落总数、生长曲线及形状鉴定（三）
2.4生物胺生成情况分析
为进一步确认这9株菌的产胺能力，将9株菌株分别接种到TSB培养基中，30℃培养3 d，分析培养液中生物胺产生质量浓度，结果如表2所示。由表2可知，9株菌均可产生色胺、腐胺和尸胺，菌株B-9生物胺生成能力较其他菌株最弱，总质量浓度为2.78 mg/L。B-1、B-3和B-7的产胺能力较强，总生物胺质量浓度分别为40.4、41.3和50.3 mg/L。其中B-1的色胺产生质量浓度最高，为38.9 mg/L；B-3亚精胺产生质量浓度最高，为31.2 mg/L；B-7酪胺产生质量浓度最高，为38.5 mg/L。
表2菌株的生物胺生成情况
a-9株菌株在0℃下的生长曲线;b-9株菌株在30℃下的生长曲线
图2九株菌株在0℃和30℃下的生长曲线
2.5生物胺产生菌的形态特征
将3株产胺量最高的菌株进行革兰氏染色，显微镜下观察。从显微镜下观察到B-1为革兰氏阴性菌，菌落形态为乳黄色圆形凸起菌落，边缘整齐，菌株为球状菌，无芽孢。B-3为革兰氏阴性菌，菌落形态为圆形，表面光滑不透明，乳黄色，边缘整齐，菌株为杆状菌，无芽孢。B-7为革兰氏阳性菌，菌落形态为白色凸起，边缘整齐，表面光滑圆润，菌株为球状菌，无芽孢。
2.6生物胺产生菌的鉴定
2.6.1生理生化实验鉴定
VITEK 2鉴菌仪是通过将检测菌株的各项生理生化实验反应结果与已知的菌株数据库作比较，从而推测菌株的可能性概率，可信概率范围为85.0%～99.0%。经鉴定，3株菌株的生理生化实验结果如表3所示。鉴定B-1菌株为巨型球菌(Macrococcuscaseolyticus)，可信概率为99.0%；B-3菌株为产碱普罗威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)，可信概率为97.0%；B-7菌株为粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)，可信概率为99.0%。
表3菌株鉴定结果
2.6.2 16S rDNA鉴定
琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物图片结果如图3所示，电泳可成功扩增出预期的DNA片段，且2 000 bp处扩增条带清晰明亮，所以该PCR片段可同时作为后续PCR反应中的引物和模板，送检测序。
图3三株菌株的琼脂糖凝胶电泳图
将测序结果与NCBI数据库进行比对，并建立系统进化树，结果如图4所示。从比对结果可知，样本B-1与溶酪巨型球菌(Macrococcuscaseolyticus)亲源关系最近，样本B-3与产碱普罗威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)亲源关系最近，样本B-7与粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)亲源关系最近。由于溶酪巨型球菌(Macrococcuscaseolyticus)为细菌致病菌，可引起一些水产动物大量死亡，推断B-1来自外界环境，并随着贮藏时间的增加，逐渐成为金枪鱼腐败菌中的优势菌种。产碱普罗威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)和粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)是人和动物肠道的正常菌群，但由于金枪鱼体型较大，肠道污染可能性较小，因此推断B-3与B-7同样来自外界环境。
图4基于16S rDNA序列构建的进化树
3结论
本研究利用生物胺初筛培养基结合高效液相色谱技术，从大眼金枪鱼生鱼片中筛选出9株生物胺产生菌，其中3株产胺量最高的菌株分别为溶酪巨型球菌(Macrococcuscaseolyticus)、产碱普罗威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)和粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)。溶酪巨型球菌(Macrococcuscaseolyticus)和产碱普罗威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)均属于新发现的生物胺产生菌。粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)曾被LADERO等从乳制品中分离得到。产碱普罗威登斯菌(Providenciaalcalifaciens)能够引起人体食物中毒、严重的肠胃炎、腹泻等疾病，对人体健康有潜在的危险性。
研究表明，根据产胺菌的生物学特性，可通过抑制相关菌群和低温贮藏相结合的方法来控制生物胺的生成，保证大眼金枪鱼的品质和食用安全性。
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