lmo1508/lmo1509基因缺失对单增李斯特菌生长曲线、抗氧化应激能力的影响（二）
1.4 gsh-px报告质粒的构建
1.4.1 目的片段的扩增
以10403S基因组为模板，利用表2中的pFL516 A/B引物对扩增gsh-px的启动子片段Pgsh-px；以pFL251为模板，利用pFL516 C/D引物对扩增gfp片段，PCR产物使用胶回收试剂盒进行回收纯化。以上述PCR扩增获得的Pgsh-px启动子和gfp为模板，用pFL516 A/D引物对进行SOE-PCR获得pFL516（Pgsh-px-gfp）目的片段，使用DNA回收试剂盒将融合片段回收备用。
1.4.2 报告质粒的构建
采用重组的方法将Pgsh-px-gfp目的片段与SalⅠ单酶切的载体质粒pERL3连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，长出菌落后挑单菌落进行PCR鉴定。将PCR鉴定阳性的克隆送至武汉擎科生物技术有限公司进行测序验证。将测序正确的gsh-px报告基因重组质粒命名为pFL516。
1.5 荧光蛋白表达菌株的构建
提取构建成功的pFL516质粒，利用电转化法将pFL516质粒电转入LM菌株10403S感受态细胞中，电转程序为：2.5 kV、400 Ω、25 μF，电击完成后加入1 mL含0.5 mol/L蔗糖的BHI培养基，置于37 ℃静置培养3 h后涂布于含10 μg/mL红霉素的BHI平板，37 ℃培养24~48 h，挑取单菌落使用pFL516 A/D引物对进行PCR鉴定，PCR产物使用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.6 荧光蛋白表达观察
取10 μL过夜培养的10403S-pFL516涂布到载玻片上，使用荧光显微镜观察细菌GFP表达情况，同时使用未转入pFL516的野生株10403S作为对照。另取1 mL菌液于1.5 mL离心管中，12 000 r/min离心2 min，弃去上清液后用1 mL PBS将细菌沉淀重悬，重悬完全后加入到96孔板中，每孔200 μL，3个重复，利用酶标仪检测菌液的相对荧光单位（RFU，即荧光值）。数据结果为3个重复试验的平均值。
1.7 gsh-px基因调控因子的筛选
将gsh-px的报告质粒pFL516电转进TCS缺失株中，涂布于含红霉素抗性的BHI平板上，置于37 ℃培养24~48 h，挑取单菌落进行PCR鉴定，经凝胶电泳检测PCR结果，获得携带pFL516报告基因的菌株。通过检测绿色荧光的强度对gsh-px基因转录水平进行评价，荧光值越高说明转录水平越高，反之则说明转录水平越低，以亲本株10403S-pFL516为对照组。
将携带gsh-px报告质粒的TCS缺失株划线于含红霉素抗性的BHI平板上，次日挑取单菌落于3 mL BHI培养基中，置于37 ℃摇床过夜培养。每个菌株各取1 mL菌液于离心管中，12 000 r/min离心2 min后弃去上清液，非应激样品用1 mL PBS将细菌沉淀充分重悬，应激样品用5 mmol/L Cu2+和10 mmol/L Fe3+应激处理1 h后用1 mL PBS将细菌沉淀充分重悬，每孔200 μL，3个重复，测量细菌菌液的荧光值。试验数据使用GraphPad Prism 5进行统计分析并作图。
1.8 生长曲线测定
分别从亲本株10403S、缺失株Δlmo1508/lmo1509的固体平板上挑取单菌落接种于液体BHI中，37 ℃条件下振荡培养过夜，以1∶100比例接菌至新的BHI培养基中，并分装到96孔细胞培养板中，37 ℃恒温培养，使用酶标仪测定OD600 nm值，每隔1 h测定1次，直至进入平台期，并据此绘制出生长曲线。试验重复3次取平均值。
1.9 氧化应激试验
为了确定报告基因筛选出的TCS的调控作用，将pFL516报告基因荧光值显著升高的TCS缺失株进行金属离子氧化应激存活试验，参考张钰等方法进行。12 000 r/min离心2 min收集过夜培养的菌体，并用PBS洗涤一次，然后稀释至OD600 nm值为0.6。将稀释好的菌液分别加入终浓度为5 mmol/L Cu2+和10 mmol/L Fe3+的BHI培养基中，37 ℃静置处理1 h。应激处理后10倍倍比稀释菌液，稀释菌液进行点板后过夜培养，并统计菌株存活率。试验重复3次。若pFL516荧光值及5 mmol/L Cu2+和10 mmol/L Fe3+金属离子氧化应激存活试验结果均有显著差异且结果一致时则可初步确定该TCS为GSH-Px的调控因子。