鸭瘟病毒基因缺失株rDEV-ΔVP26生长曲线、蚀斑面积及免疫原性分析（三）
2.3重组病毒的一步生长曲线
测定重组病毒rDEV-ΔVP26和亲本毒株rDEV-EF1在CEFs上的一步生长曲线并进行比较，如图4所示，rDEV-ΔVP26株和rDEV-EF1株具有相似的增殖趋势。rDEV-ΔVP26株的滴度在接种CEFs后稳步增加，到84 h时达到峰值，病毒滴度为105.36 TCID50·0.1 mL-1。rDEV-EF1稳步增加到60 h达到峰值，病毒滴度为105.6 TCID50·0.1 mL-1。在此期间rDEV-ΔVP26滴度较亲本毒株rDEV-EF1有所降低，说明UL35基因缺失会轻微影响病毒增殖，并降低病毒滴度。
图4 rDEV-ΔVP26和rDEV-EF1在CEFs细胞上的一步生长曲线
2.4重组病毒蚀斑面积测定
rDEV-EF1和rDEV-ΔVP26感染细胞48 h，各拍摄病毒蚀斑照片100个，并用ImageJ软件测量各个蚀斑面积并计算平均值。发现rDEV-ΔVP26蚀斑面积较rDEV-EF1减少10.60%(P＜0.05)(图5)。
图5基因缺失病毒rDEV-ΔVP26和对照病毒rDEV-EF1在CEFs细胞上的蚀斑面积测定和比较
2.5 UL35基因缺失病毒的安全性分析
各组免疫后观察2周，发现各剂量的rDEV-ΔVP26组、rDEV-EF1组和DMEM对照组鸭子精神状态良好，均未出现死亡(表2)。
表2不同剂量rDEV-ΔVP26免疫鸭对鸭子的安全性试验
2.6 UL35基因缺失病毒的免疫原性分析
在免疫rDEV-ΔVP26或rDEV-EF1 14 d后，用同一剂量的DEV CHv株(100 DLD50)进行攻毒，于2周内观察鸭的发病和死亡情况(图6)，发现1×104 TCID50的rDEV-ΔVP26免疫组鸭在攻毒5 d后死亡2只，保护率为75%；1×104 TCID50 rDEV-EF1免疫组鸭在攻毒后5 d死亡1只，保护率为87.5%；1×105 TCID50 rDEV-ΔVP26免疫组鸭和1×105 TCID50 rDEV-EF1免疫组鸭无死亡，保护率为100%。DMEM对照组鸭在攻毒后全部发病并死亡，其中第4天死亡1只，第5天死亡6只，第6天死亡1只。正常对照组试验期间全部存活。对各组鸭的存活率进行统计，注射1×105 TCID50 rDEV-ΔVP26组的存活率与亲本对照组rDEV-EF1保护率相同，均为100%。注射1×104 TCID50 rDEV-ΔVP26组的存活率较亲本对照组rDEV-EF1下降12.5%。该研究结果表明，1×105 TCID50的rDEV-ΔVP26免疫麻鸭后，诱导针对DEV强毒株的免疫保护能力与亲本疫苗株相同。
分别用两种剂量(1×104 TCID50和1×105 TCID50)的rDEV-ΔVP26和对照毒株rDEV-EF1免疫鸭后14 d，用DEV强毒株对免疫鸭进行攻毒，统计鸭的存活率。
图6 rDEV-ΔVP26的免疫保护效果
3讨论
鸭瘟是鸭、鹅和其他雁形目禽类的一种急性、热性、败血性疾病。尚无有效的治疗药物，预防接种仍是防控DEV的主要手段。目前，市场上在售疫苗主要以传统疫苗为主，包括灭活疫苗和弱毒疫苗。灭活疫苗成本高、副反应大，也存在灭活不彻底的风险。DEV鸡胚化减毒活疫苗免疫效果好，但是存在毒力返强和隐性带毒等安全隐患。通过疫苗免疫曾控制了DEV的流行，但目前鸭瘟疫情存在死灰复燃之势。近年来，在山东、江西、河北、江苏、河南、安徽、湖北、福建、广西等地蛋鸭、樱桃谷肉鸭、种鸭、番鸭均出现了新型鸭瘟疫情。虽然新型鸭瘟与传统鸭瘟，在鸭的解剖病变与症状方面存在许多相同之处，但是新型鸭瘟传播速度更快、致死率和死亡率更高，且在雏鸭开始发病。因此，亟需一种更安全有效的新型疫苗，既可进行有效防控，又能从病毒基因组水平与抗体水平将疫苗接种与野毒感染鸭区分，从而开展鉴别诊断，对感染鸭及时有效地进行淘汰。
目前，通过检测DEV UL2、LORF5基因能区分免疫的疫苗株和强毒株，但疫苗免疫后抗体水平的监测缺乏有效的评估手段。而且研究表明由鸡胚传代致弱的DEV疫苗株对鸡群是致死的，因此接种DEV疫苗株的鸭群对于混养的鸡群来说存在安全隐患。DEV VP26被证实与病毒致病性相关，UL35基因缺失株相比于DEV疫苗株理论上安全性更好。
在α-疱疹病毒中，比较成功的案例是伪狂犬病病毒(pseudorabies virus，PRV)基因缺失疫苗，缺失的靶标集中于非必需的毒力相关基因，如tk、US8(gE)、US7(gI)、US4(gG)等，PRV TK-/gE-弱毒疫苗，很早以前已经广泛应用于美国、欧盟等启动PRV根除计划的国家；PRV gE-/gI-弱毒疫苗，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所引进、国内推广应用多年、安全记录良好；由四川农业大学郭万柱等研发的PRV TK-/gE-/gI-三基因缺失病毒和由华中农业大学陈焕春团队研发的PRV TK-/gG-获得新兽药证书。这些成功的案例给人们研发鸭瘟病毒基因缺失疫苗提供了借鉴。迄今为止，多株鸭瘟病毒基因缺失株已被构建成功，并对其免疫保护能力进行了评估，如鸭瘟病毒ICP27、UL47、US3、UL44(gC)/gE、UL44、US10基因缺失株，都取得了不错的效果，但还没到应用的阶段。
本研究首次将目标瞄准衣壳蛋白，尝试研究最小衣壳蛋白缺失对病毒的影响，发现DEV UL35缺失对其病毒疫苗株安全性没有影响，但病毒传播能力和滴度都有轻微的降低，低剂量(1×104 TCID50)rDEV-ΔVP26的免疫保护能力较对照组有所下降，但高剂量(1×105 TCID50)组无差别，这个剂量与市售的一羽份鸭瘟活疫苗剂量(107.7copies·只-1，即105 TCID50)相当。对于rDEV-ΔVP26作为鉴别诊断基因缺失疫苗的可行性，笔者进行了初步评估，后续还需要开展更多的研究，如病毒接种最低剂量、接种途径、对鸡群的安全性、配套的基于VP26蛋白的间接ELISA检测技术等。
4结论
本研究在鸭瘟病毒疫苗株感染性克隆的基础上，构建了UL35基因缺失的病毒株rDEV-ΔVP26。高剂量rDEV-ΔVP26接种鸭体安全性良好，且1×105 TCID50滴度的rDEV-ΔVP26免疫组在强毒攻击下的保护率与相同剂量的rDEV-EF1对照组一致。该研究为研发用于区分疫苗免疫和野毒感染的DEV鉴别诊断疫苗奠定了基础。
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