内酯型槐糖脂对白色念珠菌生长抑制和生物膜形成的影响（一）
[摘要]目的考察和探讨内酯型槐糖脂(Lactonicsophorolipid,LSL)对白色念珠菌的浮游细胞生长和生物膜形成的影响及机制。方法以白色念珠菌为受试菌，采用微量稀释法和平板涂布法测定LSL对白色念珠菌的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MFC);利用吸光光度法测定LSL对白色念珠菌浮游细胞生长的影响并绘制抑菌曲线;通过结晶紫染色法测定LSL对白色念珠菌生物膜形成的影响。采用扫描电镜(SEM)观察LSL对菌体超微形态影响;激光扫描共聚焦显微镜(CLSM)检测处理前后细胞膜通透性变化;试剂盒检测胞内ATP和胞外紫外吸收物质含量变化。结果LSL对白色念珠菌的MIC值为6.00mg/mL,MFC值为18.00mg/mL。抑菌曲线显示LSL对白色念珠菌浮游细胞的抑制效果显著、快速且长效，所有处理组在2h内均可达到最大抑菌率。低浓度的LSL即可显著抑制白色念珠菌生物膜的形成。LSL抑制白色念珠菌生长和破坏生物膜形成的效果均与其剂量呈非线性正相关。LSL处理组细胞的细胞壁完整性和细胞膜通透性发生了明显变化，细胞出现了严重的破损和死亡现象，同时胞内ATP流失严重，胞外紫外吸收物质含量显著上升。结论LSL能够有效抑制白色念珠菌的生长和形成生物膜，具备被开发为抗菌剂或者佐剂用于治疗白色念珠菌引起的相关疾病的潜力。
白色念珠菌(Candida albicans)，又称白假丝酵母菌，是一种机会性致病真菌，主要存在于人类胃肠道和泌尿生殖道中。该真菌的过度生长与包括鹅口疮、阴道念珠菌病等在内的多种疾病相关，近年来还发现该菌与炎症性肠病、胃肠道癌等疾病息息相关。流行病学研究发现，免疫缺陷和免疫功能低下的患者以及携带医疗植入装置的患者更易感染念珠菌。目前，主要使用抗真菌药物进行白色念珠菌感染的治疗，但由于延迟诊断和白色念珠菌产生耐药性等原因，念珠菌病在世界范围内与高死亡率相关联。
生物膜是指附着于有生命或无生命物体表面被微生物胞外大分子包裹的有组织的细胞群体。不同于浮游细胞，以生物被膜形式存在的细胞对杀菌剂、恶劣环境及宿主免疫防御机制具有更强的抗性。如白色念珠菌生物膜对抗真菌药物的抵御能力是浮游细胞的10~1000倍，极大增加了相关疾病治疗的难度和风险。因此，迫切需要开发能够单独使用或与目前抗真菌药物联合使用的新型抗真菌药物，以有效对抗白色念珠菌浮游细胞和生物膜，降低白色念珠菌耐药性和应对持续性感染。
近年来，具有广泛抗菌和抗黏附活性的生物表面活性剂在医疗保健中的研究和使用越来越被关注，槐糖脂(Sophorolipids，SLs)是一类主要由球拟假丝酵母(Starmerella bombicola)等发酵产生的糖脂类生物表面活性剂，其在制药和食品行业的应用已获美国FDA批准。天然合成的SLs是内酯型(Lactonic Sophorolipid，LSL)和酸型(Acidic Sophorolipid,ASL)的混合物,其中,LSL具有更优秀的抗菌活性和抗肿瘤特性。SLs对某些致病性细菌和真菌的抗菌活性已被报道,但LSL对白色念珠菌浮游细胞和生物膜形成的抑制作用及抑制机制还有待进一步加强。本研究旨在考察LSL对白色念珠菌浮游细胞和生物膜形成的影响，同时探讨LSL介导的白色念珠菌生长抑制和生物膜抑制机制，以期为白色念珠菌引起的相关疾病的临床治疗提供参考。
1、材料与方法
1.1菌株白色念珠菌(Candida albicans ATCC10231)，购于美国典型培养物菌种保藏中心(ATCC)，现保存于实验室。
1.2主要试剂内酯型槐糖脂(LSL)由实验室使用熊峰生假丝酵母(Starmerella bombicola)以葡萄糖和菜籽油为底物发酵后经分离纯化获得，产品纯度为95%;沙氏培养基购自国药集团化学试剂有限公司;羧基荧光素双乙酸酯(cFDA)、碘化丙啶(PI)、1.0%结晶紫染料、BC0300 ATP测定试剂盒购自北京Solarbio科技有限公司。
1.3主要仪器设备UV759CRT紫外-可见分光光度计购于上海佑科仪器仪表有限公司;HX-10N-50B真空冷冻干燥机购于上海沪析实业有限公司;3K30冷冻高速离心机购于德国Sigma公司;GeminiSEM 450场发射扫描电子显微镜(SEM)和FV1000激光共聚焦显微镜(CLSM)均购于德国蔡司公司;318C酶标仪购于上海沛欧分析仪器有限公司。
2方法
2.1LSL对白色念珠菌MIC和MFC的测定
使用液体沙氏培养基溶解LSL，制备不同浓度的LSL溶液。取100μL培养至对数生长期的白色念珠菌菌液（菌浓调整为1×10⁶ CFU/mL）与等体积LSL溶液混合，使LSL终浓度梯度为0~20 mg/mL。将混合液分别加入Biosense系统专用孔板中，设置系统参数为37℃连续培养12 h，并启动自动光学监测模块（检测波长600 nm），实时记录菌液吸光度（A₆₀₀）的动态变化。当某一浓度下的菌液生长曲线进入平台期且吸光度变化率持续低于5%时，系统自动判定该浓度为LSL对白色念珠菌的MIC。分别取大于MIC浓度的各LSL-菌液混合液100μL，涂布于固体沙氏培养基平板上，37℃培养24 h后观察菌落生长情况。以无菌落生长的平板对应的最低LSL浓度作为LSL对白色念珠菌的MFC。每组测定实验重复3次，每次测定设置3个平行样本。
2.2LSL对白色念珠菌生长的影响
以抑菌率(%)为指标考察LSL对白色念珠菌的生长抑制作用。配制含不同浓度LSL的液体沙氏培养基,灭菌后按2.0%(v/v)的接种量将已活化至对数生长期的白色念珠菌(菌浓已调整为1x106CFU/mL)接种至不同培养基中恒温振荡培养12h(37℃,200rpm),每组重复3次并设未添加LSL的阴性对照组以及未接种的空白培养基对照组。每隔2h分别吸取培养物200μL于96孔板中测定A600，根据抑菌率计算公式计算抑菌率并绘制时间-抑菌率曲线。抑菌率(%)=[1-(实验组A_{600^{-}}空白组A_{600})÷(阴性组A_{600^{-}}空白组A_{600})]X 100%。
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