10种硫醚类香料对金黄色葡萄球菌生长曲线、nuc基因表达量的影响（二）
1.3.3菌种的活化及培养取-80℃冰箱中冻存的菌液100μL于100 mL的液体培养基中进行第1次传代，在37℃下震荡培养24 h后，在固体培养基上进行第2次传代，在37℃恒温箱培养12 h后，挑取单菌落至液体培养基并在37℃下震荡培养12 h。配制无菌的生理盐水并用其将上述得到的菌液稀释至107 CFU/mL，保存于4℃冰箱中备用。
1.3.4抑菌圈的测定抑菌圈的测定采用了滤纸片法。取100μL上述被稀释后的菌液于固体培养基上，用玻璃珠摇匀，使菌液能够均匀地分布在整个固体培养基上，将准备好的无菌直径为1 cm的滤纸片放置平板中央，添加6μL浓度为5 mol/L的硫醚类香料于滤纸片上，最后将固体培养基放置于37℃的培养箱中培养18～24 h。每种硫醚类香料进行3次平行试验，最终结果取平均值。
1.3.5最低抑菌浓度的测定根据1.3.4节试验结果选取抑菌效果最好的硫醚类香料作为研究对象，用二倍稀释法测定它的最低抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC）。用60%的乙醇水溶液将5 mol/L的硫醚类香料进行2倍稀释，分别为2.5，1.25，0.625，0.3125 mol/L以及0.15625 mol/L。精确量取0.1 mL菌液添加至0.8 mL的液体培养基中，再将0.1 mL不同浓度的硫醚类香料分别添加至液体培养基中，震荡混匀之后，在37℃下培养24 h。再取培养完之后的菌液100μL接种于固体培养基中，用玻璃珠震荡混匀后，在37℃下培养24 h。最后观察固体培养基上是否有菌生长，并且以无菌生长的硫醚类香料的最低浓度为MIC。每个浓度做3次平行试验，最终结果取平均值。
1.3.6硫醚类香料对生长曲线的影响
根据1.3.4节和1.3.5节结果，将抑菌能力最强的硫醚类香料稀释至亚抑菌浓度1/16MIC、1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC和MIC。先取1 mL的菌液于99 mL的液体培养基中培养，再将0.1 mL各亚抑菌浓度下的硫醚类香料分别滴加到液体培养基中，以仅添加0.1 mL无水乙醇的菌液为对照组，37℃下震荡培养24 h，并且每隔2 h测一次菌液在波长600 nm下的吸光度值，以吸光度值为纵坐标，时间为横坐标，绘制供试菌的生长曲线。
1.3.7 RNA的提取和反转录荧光定量PCR在液体培养基中添加各亚抑菌浓度的硫醚类香料，以未添加硫醚香料的为对照组，培养12 h后，取适量的菌液，按照RNA试剂盒的说明书提取RNA并反转录为cDNA即可。nuc基因引物：上游5'-GCGATTGATGGTGATACGGTT-3'、下游5'-AGCCAAGCCTTGACGAACTAAAGC-3'；16S rRNA内参基因引物：上游5'-GCTGCCCTTTGTATTGTC-3'、下游5'-AGATGTTGGGTTAAGTCCC-3'。最后在65～90℃的范围内建立熔解曲线，采用方程法2-ΔΔCT来确定基因的相对表达量。
1.4数据分析与处理
所有的数据都以平均值±标准差来表示，并均用SPSS软件进行显著性分析。
2结果与分析
2.1硫醚类香料对金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的抑制效果
将各硫醚类香料都稀释至5 mol/L，在此浓度下对金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的抑制效果见表2。结果表明，在10种硫醚类香料中，有9种抑制了金黄色葡萄球菌的生长，有7种抑制了单增李斯特菌的生长，说明单增李斯特菌对硫醚类香料不如金黄色葡萄球菌敏感，其中DMTS、DADS、DAS、MMTF、MFDS、FIPDS对金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌均有抑制作用，MPDS、DPDS和BMFDS只对金黄色葡萄球有抑制作用。
表2 10种硫醚类香料抑制作用
注：“-”表示无抑菌效果，“＋”表示有抑菌效果。
2.2硫醚类香料的抑菌作用
选取具有抑菌能力的硫醚类香料进行抑菌试验，得到的抑菌圈结果如图1所示。在图1a中，9种硫醚类香料对金黄色葡萄球菌的抑制作用各不相同，抑菌能力依次为：BMFDS≈DADS＞MFDS≈DAS＞FIPDS≈MMTF＞DMTS≈MPDS≈DPDS。BMFDS和DADS有显著的抑菌效果，抑菌圈直径分别达到（2.83±0.21）cm和（2.46±0.35）cm。在图1b中，7种有抑菌作用的硫醚类香料对单增李斯特菌的抑菌能力为：DADS＞MFDS＞MMFDS≈MMT F≈FIPDS＞DAS≈DMTS，其中DADS有最强的抑菌效果，抑菌圈直径为（1.98±0.22）cm。
图1硫醚类香料对金黄色葡萄球菌（a）和单增李斯特菌（b）的抑制作用
注：不同字母表示显著性差异（P＜0.05）。
MPDS和DADS虽然含有相同数目的硫原子，但是侧链不一样，MPDS的-S-S-两侧连接的基团是甲基和丙基，DADS是烯丙基，DADS对金黄色葡萄球菌的抑菌效果比MPDS强（P＜0.05），并且根据2.1节得出MPDS对单增李斯特菌无明显抑制作用，可以推测出由于DADS的侧链中烯丙基或是双键的存在，增强了硫醚类香料的抑菌活性。这与前期研究含有双键可能会影响二硫醚类化合物的抑制效果，存在二烯丙基的单硫醚化合物会有很好的抑制效果的结论相似。
DADS和DAS虽具有相同的侧链烯丙基，但是前者拥有的硫原子多于后者，DADS中有2个硫原子形成了二硫键。从图1结果可以看出，DADS对金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌的抑制能力均强于DAS（P＜0.05），可见对于结构简单的对称型硫醚类香料，侧链的基团相同，随着所含硫原子数目的增多，抑菌能力增强。