从儿童到成人：面部皮肤菌群成熟过程中的菌株建立与稳定规律（二）
个体中表现为中性共存的谱系层级菌群
接下来，我们在谱系层面刻画了种内多样性及其动态变化，这是理解微生物迁移行为所必需的分辨尺度。由于判断菌株是否属于同一谱系需要全基因组级别的分辨率，我们采用了一种高通量的、基于培养的方法。研究聚焦于8个家庭单元，这些家庭中每个至少包括3名成员，且均包含至少一位家长和一位儿童。我们从每位个体在每个时间点采集的样本中分离菌株，在温和的选择性培养条件下获得了单克隆菌落，并对其进行全基因组测序。平均而言，每个样本中获得了47株痤疮丙酸杆菌（C.acnes）（范围：0–133）和45株表皮葡萄球菌（S.epidermidis）（范围：0–186）。由于各个个体获得的分离株数量不一，我们在分析中设定了纳入阈值，具体标准详见正文、图注及STAR方法部分。最终，我们共获得了4,055个菌株，并将其聚类为167个谱系（每个谱系包含至少3株分离株）。
我们采用的聚类方法确保同一谱系内的菌株彼此间的亲缘关系高于其与其他谱系菌株的亲缘关系（详见STAR方法）。尽管同一谱系的菌株之间可能存在一定的基因组内容差异，但本研究主要基于单核苷酸多态性（SNP）进行谱系划分，因为SNP的积累具有相对稳定的“分子时钟”特性，有助于推断传播过程。在全基因组范围内，同一谱系中的痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌菌株之间的SNP差异分别不超过62和90个位点（图2A），说明这些菌株拥有共同的近期祖先，其演化历史可追溯至个体生命期内，因此很可能通过近期传播事件建立了亲缘关系。
图2|个体中亲缘关系密切的谱系的共存(A)两个物种的谱系之间亲缘关系非常密切，在整个基因组范围内，同一谱系内的最大遗传距离仅为90个SNP（2,025株表皮葡萄球菌的最大为90个SNP，2,030株痤疮丙酸杆菌的最大为62个SNP），表明这些菌株拥有共同的最近共同祖先（MRCA），其存在于个体生命周期之内。(B)对于这两种细菌，我们几乎总是在同一时间点观察到多个谱系共存。对于每个样本，纳入分析的谱系包括从分离株或宏基因组数据中检测到的所有谱系。仅纳入同时满足两个条件的样本：（1）分离株数量大于25株；（2）宏基因组中谱系级别分类覆盖率超过70%。最终纳入的样本数量为痤疮丙酸杆菌的26个，表皮葡萄球菌的13个。图中的垂直线表示中位数。(C)对于两种菌，在同一宿主体内共存的亲缘谱系之间的平均基因组内容差异，并未显著高于随机预期，这与代谢生态位分化（metabolic niche partitioning）所预期的情况一致。共存谱系与（B）中所用相同，基因组内容差异基于谱系联合组装分析（详见STAR方法）。p值表示在10⁵次蒙特卡洛模拟中，小于观察值的比例乘以2。
为更好地检测那些因丰度较低而在培养过程中未被发现、但在个体间共享的谱系，我们还利用宏基因组方法评估了谱系组成（详见STAR方法）。这也使我们能够在未获得任何分离株（因此也无法定义谱系）的受试者中，以较粗略的种内分辨率分析其种内多样性。在同时具备足够分离株和宏基因组数据的个体中，宏基因组推测的谱系丰度与培养推测的丰度显著相关（痤疮丙酸杆菌：p=5.1×10⁻²²，R²=0.55；表皮葡萄球菌：p=3.8×10⁻¹⁸，R²=0.82）。在所有受试者中，我们发现多谱系共存在两种菌中都十分常见（图2B；痤疮丙酸杆菌的中位共存谱系数为7，表皮葡萄球菌为6），这一结果与先前研究一致。在某些个体中，甚至可观察到多达11个来自同一物种的谱系同时共存。为了检验这些共存的同种谱系是否占据了功能上不同的生态位，我们分析了共存谱系之间的基因组内容和系统发育距离。
如果谱系因功能差异而共存，理论上应出现“过度离散”（overdispersion）现象——即同一宿主体内的谱系间差异大于随机抽样所得的期望差异。但无论是在基因组内容还是系统发育距离方面，我们在这两种菌中均未观察到过度离散现象（图2C），这表明亲缘关系密切的谱系也可以共存。尽管这些结果无法完全排除存在低于检测限的生态位分化或生态位过滤，但它们支持一个中性模型：痤疮丙酸杆菌和表皮葡萄球菌的亲缘谱系可在面部皮肤上共存，且共存并不必然依赖于功能差异。
家庭成员之间共享部分（但非全部）谱系
正如肠道和口腔微生物组研究所揭示的那样，谱系在家庭成员之间广泛共享，但在家庭之间则不常见。我们将宏基因组数据与分离菌株结果结合，以检测潜在的低丰度谱系共享，结果发现仅有47%的痤疮丙酸杆菌谱系和44%的表皮葡萄球菌谱系在同一家族的两位或以上成员之间存在共享证据（数据来源包括宏基因组和分离菌株，详见STAR方法）。相比之下，在同一所学校的非家庭成员之间，仅发现2个痤疮丙酸杆菌谱系在宏基因组样本中被共享，而表皮葡萄球菌的共享谱系为0。
在这两例跨家庭共享中，相关谱系在其中一位个体体表的丰度均低于5%，这可能提示实验或计算误差。此外，还有5个痤疮丙酸杆菌谱系和8个表皮葡萄球菌谱系的分离菌株来自多个家庭的个体；但这些共享事件并未在宏基因组中得到支持。尽管这些情况涉及同一学校的学生，理论上可能代表短暂的传播，但由于这些谱系的分离菌株数量较少，无法排除实验误差的可能性。
总体而言，这些结果表明谱系共享更可能发生在密切接触的人群之间。值得注意的是，尽管存在因接触而可能发生的传播，家庭成员仍保留了彼此独特的微生物群落。同一受试者在不同时间点采集的样本之间相似性明显高于来自同一家族中其他成员的样本。此外，大多数父母所携带的谱系并未在配偶之间共享（痤疮丙酸杆菌：37个谱系中有23个未共享；表皮葡萄球菌：28个谱系中有23个未共享，详见STAR方法）。
这些个体特异谱系常常在其宿主体内具有较高丰度，表明这不仅仅是检测灵敏度或接触机会不足造成的假象。这种不完全共享表明，在成人之间存在一定的传播屏障，这种屏障可能是中性的（例如“优先效应”）或选择性的（例如个体特异的定植选择），其中表皮葡萄球菌的传播屏障似乎更为显著。
图3|尽管物理传播障碍较低，家庭成员之间仍并不共享所有谱系(A)对于这两种细菌，家庭成员之间共享部分谱系，但并非全部。谱系归属是基于宏基因组样本中谱系级别分配率超过70%的数据判定的。我们选用了Jaccard距离作为相似性衡量指标，因为该指标对丰度差异不敏感，并基于每位个体所有样本中检测到的谱系计算得出。家庭成员之间的Jaccard距离分布（绿色，痤疮丙酸杆菌n=17，表皮葡萄球菌n=13）显著低于同一受试者不同时间点样本之间的距离（红色，痤疮丙酸杆菌n=27，表皮葡萄球菌n=11）。而来自同一学校但非家庭成员之间的共享（黑色，痤疮丙酸杆菌n=154，表皮葡萄球菌=92）极为罕见。(B–D)当谱系在不同个体之间共享时，其传播方向并不总是明确，但系统发育树的拓扑结构显示多细胞传播是常见现象。
图中展示了来自同一家族的三个系统发育树示例，箭头表示推断出的最小传播基因型至目标个体的方向。系统发育树(B)清楚地显示出从父亲8PB向其子女8AB的传播；(C)显示向子女8AC的传播存在单细胞瓶颈，但传播来源（父母哪一方）尚不明确；(D)显示父母8PA与子女8AB之间存在多次传播，方向不明确。(E)统计了所有谱系中（痤疮丙酸杆菌为89个，表皮葡萄球菌为78个）能够明确传播方向、传播方向不明确、以及未发生共享的比例。(F)在所有谱系和接收者中，解释谱系多样性所需的最小传播基因型数通常大于1（痤疮丙酸杆菌n=15，表皮葡萄球菌=17，中位数均为2，图中竖线所示），提示在一个或多个时间点发生了多个细胞的迁移。
同一谱系被三人或以上共享时，每位接收者计为一次。p值来自双边秩和检验，均使用Benjamini-Hochberg方法控制假发现率为5%，结果均具有统计学显著性。