多杀性巴氏杆菌分离鉴定、分型、药敏试验及小鼠致病性试验（四）
3讨论
Pm是猪群中重要的细菌性病原菌之一，猪感染多杀性巴氏杆菌可引起肺炎、萎缩性鼻炎、脑膜炎以及败血症，其在世界范围内广泛流行，严重影响养猪业的发展。近年来关于猪源Pm的分型、耐药性及毒力分析多有报道，Pm引起的疾病类型和致病性与荚膜型有一定关系，何娅等筛选出荚膜A型菌株毒力最强的菌株60 CFU·mL-1可使小鼠全部死亡。本研究显示，荚膜A型菌株毒力强于荚膜D型菌株，PmA1菌液浓度为31.5 CFU·mL-1时可使小鼠全部致死，其毒力较强。此外，本研究分离到的Pm菌株在添加5%脱纤维绵羊血的TSA板上培养，荚膜A型菌落较荚膜D型菌落大，其与致病力的关系有待进一步探究。笔者后期研究也验证了不同荚膜血清型之间保护力低(数据未发表)，因此Pm的分型有利于展开疫苗研究。近年来，我国猪源Pm的流行以A:L3、A:L6、D:L6为主。本研究对34株猪源Pm分型结果表明，当前所涉及省份的猪源Pm仍以这三类为主要流行型。猪源Pm中A型菌株的占比在不断提高，D型菌株占比不断减少。本研究分型鉴定出1株荚膜F型菌株，近年来从猪群中分离出荚膜F型菌株多有报道，尽管荚膜A型和D型仍为当前的流行株，但F型菌株有增多趋势，提示猪源F型菌株有可能成为流行血清型之一。方超等研究发现，荚膜F型菌株对小鼠具有强致病力，这提示Pm的荚膜F型菌株对猪群的危害性可能较大，对Pm的防治难度将大大增加。
A.小鼠腹腔注射PmA1菌株；B.小鼠腹腔注射PmD4菌株
图6小鼠生存曲线
王豪男将23株猪源Pm进行MLST基因型检测，其中ST11序列类型的菌株占据优势。彭忠等将80株猪源Pm进行MLST基因型检测，发现主要流行的为ST11、ST10和ST3；本研究中34株猪源Pm中ST11型菌株占主导地位，ST3、ST10、ST117次之，与文献报道一致。值得注意的是，荚膜型和脂多糖基因型分别有3种和2种，由此可见MLST分型比传统的血清型分型方法更为精细，而同一荚膜型其ST分型不同，说明Pm在猪群中的流行较为复杂，对其防控增加了难度。PFGE是细菌分型和分子流行病学研究的首选方法。通过PFGE对34株Pm进行分型，以确定不同分离株的遗传多样性，结果显示，同一荚膜型、ST型的菌株在PFGE图谱上表现出一定的相似性，例如Pm294和Pm290均为A型且MLST分型为ST3，它们的PFGE图谱显示出较高的相似性，提示它们有共同的进化起源；值得注意的是尽管不同菌株荚膜型，MLST分型均相同，PFGE图谱中的条带数量和大小存在差异，这可能是不同菌株间基因组大小和基因组内的限制性酶切位点分布不同所致，不同菌株的碱基不同或存在碱基突变等情况，其酶切位点及酶切后的图谱不同。此外，有文献报道，同一地区分离株PFGE谱型不同，证明其具有遗传多样性。该方法也有利于在筛选疫苗候选株中减少实验动物的使用。
抗菌药物的使用是临床治疗Pm等细菌性疾病的有效手段，为此定期监测耐药性是指导临床用药的重要环节。环丙沙星，氟苯尼考是动物养殖业中广泛使用的抗菌药物，据文献报道，中国和其他国家主要使用大环内酯类抗生素和氟喹诺酮类药物治疗多杀性巴氏杆菌引起的感染，因此，使用此类药物在治疗多杀性巴氏杆菌病时效果降低。本研究的MIC结果显示，Pm对环丙沙星和氟苯尼考的耐药率分别为8.82%和23.53%，具有一定耐药性，与宋强强等报道的对氟苯尼考耐药率25.81%一致，临床应减少此类药物的使用。Pm对四环素的耐药率为35.29%，明显低于胡星星等报道的对强力霉素的耐药率83.64%；而对多黏菌素B的耐药率为38.23%，明显高于1.82%；这种耐药性的地域差异，往往与当地气候、饲养方式以及用药策略有关。四环素类药物的耐药基因检出率为29.41%，四环素耐药表型和耐药基因检出的情况具有较高的符合率。本研究分离株检出氯霉素耐药基因，但其对氯霉素展现敏感表型，Pm氯霉素耐药基因和表型不一致。Petrocchi-Rilo报道中也出现此种现象，β-内酰胺、四环素、大环内酯耐药基因的检出与Pm表型不相符，这表明耐药基因型与耐药表型之间的对应关系并不绝对。需要注意的是，本研究中Pm对头孢噻呋的耐药率为11.7%，而宋强强等报道的结果为对头孢噻呋完全敏感，这提示临床需定期监测耐药性，科学指导用药。
4结论
本研究成功分离并鉴定了34株Pm，发现荚膜A型和D型、脂多糖基因型L3和L6型、ST11型在猪群中为当前的流行型，两种不同荚膜血清型菌株均具有致病性，A型菌株毒力强于D型菌株，PmA1菌株毒力强可作为疫苗候选株。通过分型发现，同一荚膜型的菌株PFGE谱型和ST型不同，菌株间存在多样性。34株Pm携带9种耐药基因，耐药表型与基因型有一定关系，但有耐药基因的菌株，临床抗菌药物也可能敏感，且不同地区间耐药情况不同，需要密切监测，为猪源Pm的防治和疫苗研发提供理论依据。
相关新闻推荐
2、东北某市寒区湖库型主体水和生物膜中耐氯菌数目、再生长现象研究（一）
3、综述微生物修复菲污染中降解菌的菌属、降解机理、分子机制、影响因素（二）