从菌丝到细胞：切叶蚁共生真菌原生质体的可控制备与高精度评估（一）
研究背景：以往多针对子囊菌或少数担子菌，而L.gongylophorus作为切叶蚁的共生真菌，其细胞壁富含几丁质和葡聚糖，需要定制酶配方和渗透稳定条件。研究背景是切叶蚁系统在进化生态学中的重要性，以及该真菌作为“作物”的共生机制尚不明确。本研究方案详细描述了真菌培养、缓冲液制备、酶消化步骤（使用几丁质酶、纤维素酶等）、原生质体纯化、以及通过显微镜和染色（如Calcofluor White、Trypan Blue）进行质量控制的步骤。本论文具体提出了一种方案，用于分离由叶蚁强制养殖的担子菌类真菌互利生物（Leucoagaricus gongylophorus）的活性原生质细胞。描述了培养活跃菌丝体的步骤、在渗透稳定下酶促真菌细胞壁消化，以及原生体（包覆细胞质和细胞器的质膜）纯化。随后详细介绍了利用显微镜和荧光染色评估存活能力及壁面去除的程序。本论文主要是提供一种可重复的方法，用于从切叶蚁的专性共生真菌Leucoagaricus gongylophorus中分离出有活性的原生质体（即去除细胞壁的完整真菌细胞）。主旨是解决该非模式担子菌真菌原生质体生成的技术空白，从而促进对其细胞生物学和共生机制的研究。
丹麦Biosense微生物生长动态监测系统的应用
将ocelloScope(Biosense微生物生长动态监测系统)是一种高通量、无标记的活细胞成像与分析系统，被用于实时监测和定量评估原生质体的形态完整性、浓度及活力状态。该设备通过结合全息成像（digital holographic microscopy）与人工智能驱动的图像分析算法，能够在不使用荧光染料或染色剂的情况下，对大量原生质体样本进行快速、非侵入性的三维成像和动态追踪。传统血球计数板法易受主观误差和碎片干扰，而ocelloScope能自动识别并计数具有完整球形轮廓和特定折射率特征的原生质体，从而提供更准确、可重复的细胞浓度数据ocelloScope通过分析细胞的相位信号（phase shift）和体积稳定性，间接反映细胞膜完整性和渗透调节能力，从而实现对原生质体活力的非侵入性、实时评估。这与后续的台盼蓝验证结果高度一致，证实了其可靠性。
实验结论
本研究成功建立了一种高效、可重复的原生质体制备方法，专门适用于切叶蚁共生真菌Leucoagaricus gongylophorus。通过优化酶解体系（包含几丁酶、纤维素酶、Driselase和β-葡萄糖醛酸酶）与高渗缓冲条件（1.2 M甘露醇或山梨醇，pH 6.0，25°C），研究团队从三周龄活跃菌丝体中稳定获得高产量、高活力的原生质体。经多种荧光染色和台盼蓝排斥实验验证，所获原生质体细胞壁完全去除、质膜完整、线粒体功能正常，平均存活率达98%，每2 mg湿重菌丝可产约6亿个原生质体。该成果首次为这一关键共生真菌提供了可靠的细胞操作平台，突破了长期以来因缺乏遗传和细胞工具而制约其功能研究的技术瓶颈。本方法不仅为未来开展L.gongylophorus的基因编辑、单细胞组学、代谢互作及共生机制解析奠定了基础，也为其他具有复杂细胞壁结构的非模式担子菌的原生质体制备提供了可推广的技术范式。因此，本研究在推动昆虫–真菌共生系统的基础研究和拓展真菌生物技术应用方面具有重要意义。
图1、切叶蚁共生真菌Leucoagaricus gongylophorus原生质体制备流程示意图。第一步从固体培养基上收获三周龄活跃生长的菌丝体，在含复合酶混合物（几丁酶、纤维素酶、Driselase和β-葡萄糖醛酸酶）及1.2 M甘露醇的高渗缓冲液中，于25°C、pH 6.0条件下进行酶解，经40μm尼龙滤网过滤去除未消化菌丝。第二步低速离心（100×g）收集原生质体沉淀。第三布重悬于渗透稳定缓冲液中用于后续分析或实验。
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