酪酸梭状芽孢杆菌生长与活菌计数：高层半固体琼脂试管法VS固体琼脂平板法（二）
2.5 培养基组成正交实验设计和分析
在上述碳源、氮源等单因素研究中，确定了最佳碳源、氮源和生长因子，但碳氮比和各成分适合的质量浓度对菌体的生长也有很大的影响。为进一步研究营养因子间的相关性，选取葡萄糖、酵母膏、胰蛋白胨进行L9(33)正交实验，结果见表2和表3。
| 实验号 | A 葡萄糖/ (g/L) | B 胰蛋白胨/ (g/L) | C 酵母膏/ (g/L) | 活菌数/ (108 mL-1) |
|---|---|---|---|---|
| 1 | 6 | 8 | 3 | 2.68 |
| 2 | 6 | 10 | 4 | 2.80 |
| 3 | 6 | 12 | 5 | 3.45 |
| 4 | 8 | 8 | 4 | 3.85 |
| 5 | 8 | 10 | 5 | 4.10 |
| 6 | 8 | 12 | 3 | 3.60 |
| 7 | 10 | 8 | 5 | 2.80 |
| 8 | 10 | 10 | 3 | 3.00 |
| 9 | 10 | 12 | 4 | 1.75 |
| k1 | 2.55 | 2.59 | 2.81 | |
| k2 | 3.43 | 3.32 | 2.73 | |
| k3 | 2.56 | 2.63 | 3.00 | |
| R | 0.88 | 0.73 | 0.28 |
| 因素 | 偏差平方和 | 自由度 | 方差 | F值 | 显著性 |
|---|---|---|---|---|---|
| 葡萄糖 | 1.526 | 2 | 0.763 | 5.45 | |
| 胰蛋白胨 | 1.020 | 2 | 0.510 | 3.64 | |
| 酵母膏 | 0.124 | 2 | 0.062 | 0.44 | |
| 误差 | 0.28 | 2 | 0.14 | ||
| 总和 | 2.95 | 8 |
极差分析与方差分析结果表明，碳源对活菌数量影响最为显著，其次是氮源，最后是酵母膏。即胰蛋白胨10 g/L、葡萄糖8 g/L、酵母膏4 g/L。菌体培养24 h活菌数达4.1×108 mL-1。
2.6 无机盐对芽孢转化率的影响
在前述碳、氮源配比的基础上已经可以获得较高的活菌数。但对芽孢转化率的影响变化不大。调整培养基中无机盐及微量元素配比可以提高芽孢转化率，例如，可以向培养基中添加K+、Mn2+、Mg2+、Ca2+等，特别是Mg2+能够大大提高芽孢的转化率。CaCO3还可以中和发酵液里的酸，起到调节pH的作用。故添加 K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·H2O和CaCO3到发酵培养基进行实验，结果见表4。由表4可知，第2组无机盐及微量元素配比最佳，即：K2HPO4 5 g/L、MgSO4·7H2O 0.2 g/L、MnSO4·H2O 0.2 g/L、CaCO3 1 g/L时培养32 h，其芽孢转化率可达95%。
表4 添加无机盐培养32h时的活菌数及芽孢转化率
| 组别 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| MgSO4·7H2O/(g·L-1) | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.3 | 0.3 | 0.3 | 0.4 | 0.4 | 0.4 |
| MnSO4·H2O/(g·L-1) | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.1 | 0.2 | 0.3 |
| K2HPO4·3H2O/(g·L-1) | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 |
| CaCO3/(g·L-1) | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| 活菌数/108 mL-1 | 3.70 | 4.20 | 4.20 | 3.90 | 4.00 | 4.00 | 3.80 | 3.90 | 3.60 |
| 芽孢转化率/% | 83 | 95 | 78 | 80 | 71 | 64 | 52 | 50 | 36 |
由表4可知，第2组无机盐及微量元素配比最佳，即：K₂HPO₄ 5 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L、MnSO₄·H₂O 0.2 g/L、CaCO₃ 1 g/L时培养32 h，其芽孢转化率可达95%。
3 结论
通过比较固体琼脂平板法和高层半固体琼脂试管法测定发酵液中的活菌数的准确性，确认高层半固体琼脂试管法有良好的厌氧性能(P<0.05)。采用高层半固体琼脂试管法进行酪酸梭状芽孢杆菌的活菌计数，在准确反映活菌数的同时，还有明显缩短培养时间，减少培养成本等优点。
通过单因素实验对酪酸梭状芽孢杆菌的发酵培养基中碳源、氮源、生长因子进行研究，确定最佳碳源为葡萄糖，氮源为胰蛋白胨，生长因子为酵母膏。采用正交实验进一步优化，得到合适的配比，即：葡萄糖8 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母膏4 g/L。此时活菌数可达4.1×10⁸ mL⁻¹。
通过调整添加无机盐和微量元素之间的配比，当添加 K₂HPO₄ 5 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L、MnSO₄·H₂O 0.2 g/L、CaCO₃ 1 g/L时培养32 h，芽孢转化率可达95%。最终优化后发酵培养基配方为：葡萄糖8 g/L，胰蛋白胨10 g/L，酵母膏4 g/L，K₂HPO₄ 5 g/L、MgSO₄·7H₂O 0.2 g/L、MnSO₄·H₂O 0.2 g/L、CaCO₃ 1 g/L。此培养基与其他发酵培养基配方相比，不但保持了同样的活菌数，提高了芽孢转化率，而且简化了培养基，降低了发酵成本。
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