一 实验准备
1 菌株活化与菌悬液制备
目标丝状真菌菌株按照标准方法活化传代培养，制备纯孢子悬液，使用血球计数板计数校准孢子浓度，去除菌丝碎片杂质，过滤纯化孢子悬液。
用对应液体培养基（如RPMI 1640、SDB等）稀释孢子悬液，配制统一初始接种浓度，常规起始浓度控制在1×10³~1×10⁴ CFU/mL，避免初始密度过高造成菌丝快速融合粘连；不添加琼脂，全程使用纯液体培养体系。
设置空白对照孔（仅纯液体培养基）、复孔（每条件至少3个复孔）、阳性对照菌株孔，记录板布局信息。
2 微孔板加样与封板处理
采用透明平底96孔微孔板，每孔加入统一体积液体培养基和孢子悬液，总体积100–150μL/孔；微孔板外圈列加入无菌PBS或培养基作为缓冲孔，降低长周期培养边缘蒸发效应。
选用透气封板膜进行封板，保障通气条件同时减少液体蒸发和板盖冷凝水干扰成像；加样后低速瞬时离心，去除孔内气泡，保证液体分布均匀、菌丝在孔底正常萌发生长，避免气泡遮挡成像视野。
3 仪器与软件基础设置
将微孔板固定适配oCelloScope板架，置于设定温度（如25℃/30℃）恒温培养环境，保持全程温度稳定，避免温度波动产生培养基结晶。
连接oCelloScope主机与UniExplorer软件，选择FluidScope Z轴多层深度扫描模式，设置Z轴扫描层数与扫描范围，覆盖液体全深度以及底部贴壁菌丝区域，保证全深度菌丝均可被成像采集。
设置测量间隔：长周期丝状真菌液体培养推荐10分钟或更长间隔（可延长至30分钟），减少频繁扫描震动干扰菌丝自然生长；执行全板初始BCA基线校正，扣除空白培养基、板底背景信号，保存基线模板。
启用SESA图像分割算法，提前设置真菌菌丝分割参数，做好像素物理尺寸校准，建立像素与微米的换算关系，方便后续真实物理面积定量。
二 oCelloScope连续成像监测流程
1 启动长周期延时扫描
确认板位对齐、扫描路径无误，启动全自动时序Z轴堆叠扫描，持续监测完整菌丝发育周期（孢子萌发、延滞期、菌丝延伸、分枝生长、成熟菌丝阶段，可设置7–14天连续监测）。
全程保持培养环境静置培养，如需间歇振荡，设置扫描时段与振荡时段错峰运行，防止液体晃动导致菌丝移位、脱落，破坏原位液体菌丝结构。
软件实时保存Z轴原始图像堆栈、TA总吸收信号、SESA分割掩码图像，同步生成逐帧时序数据，全程避免人为移动微孔板。
2 图像分割与菌丝定量计算
完成BCA动态基线校正，持续消除长周期基线漂移、微小沉淀背景干扰，保证动态信号来源于真实菌丝结构。
通过SESA算法逐帧做图像二值分割，区分菌丝前景像素与液体背景像素，逐时间点计算菌丝总像素面积，通过像素校准系数换算为真实物理面积（μm²）；同时计算菌丝成像覆盖率：菌丝像素总数/单孔有效成像区域总像素×100%。
同步提取菌丝骨架长度、分枝数量、圆度等形态参数以及动力学参数：延滞期、菌丝生长速率、AUC累积面积、最大菌丝覆盖量等，完成全周期动态参数批量拟合。
区分底部贴壁主菌丝与上层游离微小菌丝团，可通过Z轴分层查看不同深度菌丝分布，减少游离悬浮菌丝信号对底层主菌丝定量的干扰。
3 异常信号质控处理
对照空白孔基线曲线，排查培养基结晶、药物沉淀、杂质颗粒造成的静态假阳性信号，利用基线校正与静态像素过滤剔除固定背景信号；标记拟合异常曲线，排除污染孔与异常复孔数据。
定期复核复孔动力学曲线重复性，确认菌丝生长趋势符合正常丝状真菌液体培养发育模式，避免整体数据失真。
三 数据导出与验证
1 批量数据导出
在UniExplorer软件中将逐帧时序菌丝面积、覆盖率、动力学参数导出为CSV格式，可导入Origin、R、Python等软件进行进一步动力学拟合、统计分析、绘图，保存原始图像堆栈文件用于结果溯源。
生成延时动态影像，记录液体菌丝整体生长演化过程，用于结果展示与方法验证。
2 终点交叉验证
可配合终点干重测定、CFU活菌计数、荧光染色成像等方法做局部验证，校准oCelloScope成像定量结果，建立菌丝像素面积与真菌生物量的对应关系，提升定量准确性。
不使用半固体琼脂，全程保持纯液体体系，记录完整扫描参数、基线校正参数、SESA算法版本，保障实验可复现。
四 关键注意事项
1 防蒸发与防冷凝管理：长周期液体培养需做好缓冲孔与封板管理，必要时配合湿度控制培养箱，防止液体体积变化改变液体深度，影响Z轴扫描精度与菌丝生长环境。
2 扫描震动控制：不可设置过短扫描间隔，减少机械扫描震动对脆弱液体菌丝结构的持续扰动，保证菌丝生长模式接近自然静态液体培养状态。
3 高密度菌丝校正：后期菌丝大量融合后整体像素定量可用，但精细单根菌丝参数会产生偏差，此时以整体菌丝总面积和覆盖率为主进行整体生物量动力学分析。
4 避免药物/营养析出：提前验证液体培养基与药物体系的溶解稳定性，减少长周期培养中结晶析出干扰成像分割。