一、基础原理与原始图像来源

通过oCelloScope FluidScope

Z轴多层堆叠扫描获取全深度时序图像堆栈，经UniExplorer软件完成BCA背景校正消除静态背景、结晶、板底干扰，再用SESA算法进行图像分割，识别菌丝/真菌像素区域与空白背景区域，生成二值化掩码图像（菌丝区域标记为前景像素，其余为背景像素）。

二、菌丝面积计算方法

像素统计法：直接统计每个微孔、每个时间点二值掩码里属于菌丝/真菌结构的总像素数量。

软件内部基于全Z层堆叠图像整合全体积有效菌丝像素，输出菌丝总面积（Total Area）参数，单位为像素面积；可通过校准参数（单像素实际物理尺寸）将像素面积换算为μm²等物理面积。

随时间逐帧记录菌丝总面积时序数据，形成菌丝面积动态曲线，进一步计算延滞期、比生长速率、AUC等动力学参数。

注意：高密度融合菌丝会影响精确单细胞分割，此时优先采用整体全孔菌丝总面积参数，而非单根菌丝参数。

三、成像覆盖率计算方法

定义：菌丝像素占微孔有效成像区域总像素的百分比

公式：成像覆盖率(%) = (菌丝有效像素总数 ÷ 单孔可成像区域总像素总数) × 100

由SESA分割掩码逐帧计算，反映菌丝占据孔内成像区域的整体占比，表征菌丝整体扩展程度、侵袭生长速率。

可做时序动态覆盖率曲线，追踪菌丝逐步铺满微孔的全过程；基线校正后再做覆盖率计算，避免背景像素计入统计造成偏差。

四、UniExplorer软件导出与后续数值转化

1. 原生参数导出：软件可直接导出时序菌丝总面积、覆盖率、骨架长度等参数为csv格式，得到逐时间点定量数值。

2. 物理尺寸校准：如需真实物理面积而非像素值，使用标准校准板进行像素-微米标定，建立换算系数，完成像素面积→实际μm²换算。

3. 整体生物量等效定量：结合BCA总吸收（TA）算法得到等效生物量读数，与菌丝像素面积数据交叉验证，构建整体动态定量体系。

4. 数据平滑与拟合：可启用软件曲线平滑功能或导出csv至Origin/R等软件做进一步拟合，计算整体累积AUC、平均生长速率等衍生定量指标。

五、关键注意事项

确保初始基线校正完成，消除固定背景像素，防止覆盖率虚高；Z轴扫描层数需匹配液体深度，保证深层贴壁菌丝像素被完整纳入统计。

区分全孔整体覆盖率和局部微菌落覆盖率，二者计算口径不同，论文中需写明算法版本、Z轴参数及计算方法以保证可复现性。