一、实验材料准备

1. 菌株与活化

选用目标菌株（细菌/念珠菌等，如白色念珠菌、金黄色葡萄球菌），-80℃甘油保存菌株连续传代活化2代，保证生理状态稳定，避免老化菌株影响生物膜黏附能力。

2. 培养基

真菌：RPMI 1640培养基（pH7.0），按需添加葡萄糖/血清促进生物膜形成，过滤除菌；

细菌：TSB培养基，高压灭菌；

配套试剂：无菌PBS、半透气防蒸发封板膜、透明平底96孔微孔板、结晶紫、95%乙醇、XTT试剂（可选）。

3. 仪器软件

oCelloScope成像系统（FluidScope Z轴扫描）、恒温培养箱、分光光度计、酶标仪、UniExplorer软件；确认微孔板板底无划痕，光路窗口洁净。

二、菌液制备与布板接种

1. 菌悬液校准

细菌：调整OD₆₀₀=0.05~0.1，终浓度约1×10⁵~1×10⁶ CFU/mL；

念珠菌/真菌孢子：终浓度约1×10³~1×10⁴ CFU/mL，避免初始浓度过高造成早期融合；

单孔加液量：常规100 μL，长周期真菌实验150 μL。

板布局：最外圈孔填充纯培养基做蒸发缓冲孔；设置纯培养基空白对照、无药阳性对照，每组≥3个复孔；平整贴附半透气封板膜，瞬时低速离心去除气泡；提前预热微孔板减少温差冷凝。

三、oCelloScope成像法动态监测步骤

1. 上机设置

将微孔板水平固定于仪器板架，整机放入恒温培养箱（37℃），远离风口和箱门，保持稳定温湿度；开启FluidScope全深度Z轴多层扫描，保证底层贴壁生物膜完整成像。

扫描间隔：细菌生物膜5 min；真菌长周期生物膜10~30 min；

算法设置：执行初始全板BCA基线校正，启用SESA形态分割算法、曲线平滑；

监测周期：细菌24–48 h，真菌生物膜7–14 d，全程静置培养避免扰动生物膜。

2. 动态数据采集与分析

连续采集Z轴时序图像，软件逐帧计算整体等效生物量、生物膜总面积、成像覆盖率及延滞期、比生长速率、最大生物量、AUC等动力学参数；可导出延时视频和csv格式参数；复核并批量剔除异常孔，排除结晶、沉淀假阳性信号；区分底层贴壁生物膜与上层浮游菌体信号。

四、比浊法对照实验

1. 间断酶标仪比浊

同批次微孔板、相同培养条件，酶标仪定时读取OD₆₀₀数值，获得整体总菌量浊度曲线；仅反映全孔总菌量，无法区分贴壁生物膜与浮游菌体，无三维结构和微观异质性信息，仅做整体总量对照。

2. 终点结晶紫经典生物膜定量

培养结束后轻柔PBS漂洗去除浮游菌，固定、0.1%结晶紫染色、漂洗脱色，乙醇洗脱后酶标仪读取OD₅₉₅，得到成熟贴壁生物膜终点总量；可辅以XTT代谢检测、CFU活菌计数验证生物膜活力。

五、数据处理与统计

1. UniExplorer批量拟合动力学参数，导出时序曲线与参数文件，保存原始图像堆栈用于溯源；

2. 使用Origin/R等软件绘制生长曲线、计算均值和标准差，进行统计分析，验证成像定量与结晶紫/比浊结果相关性；

3. 记录完整参数：Z轴层数、扫描间隔、培养条件、基线校正模板、菌株信息，保证可复现性。

六、质控与注意事项

1. 全程防蒸发、防冷凝，减少基线漂移；长周期实验定期复核复孔重复性；

2. 目视复核延时图像，排除培养基结晶、杂质沉淀造成的假阳性信号；

3. 扫描时段避免振荡，防止底层生物膜脱落；正式SCI研究需标注软件版本与算法参数。