一 方法原理与实验设计概述
抗生素后效应PAE定义：细菌短期暴露于抗菌药物，移除药物后，菌体持续受到抑制、延迟恢复生长的时长。传统PAE操作需要定时开盖离心洗涤、稀释移除药物，多次取板会造成温度波动、菌体扰动，破坏生长环境，引入系统误差。
基于oCelloScope不开盖原位连续监测方案，无需取出微孔板、无需离线洗涤操作，利用药物梯度洗脱设计或者孔内药物稀释模型，结合Z轴多层成像时序扫描，全程密闭原位采集生长曲线，连续观测药物移除后菌体恢复增殖全过程，完整计算PAE数值。
方案分为两种技术路线：路线一，孔内原位药物稀释不开盖方案（优先推荐，操作简便、适合高通量96孔）；路线二，预暴露药物后无菌培养基置换方案（适用于无法耐受稀释体系的菌株）。整套流程全程微孔板不离开培养环境，仪器持续时序扫描，无开盖扰动。
二 实验前期准备
1 菌株、培养基与试剂准备
受试细菌使用MH肉汤，标准菌株连续传代2次活化；37℃振荡培养至对数生长期，调整菌悬液浓度至5×10⁵ CFU/mL。
受试抗生素配制10×母液，0.22μm滤膜过滤除菌；准备无菌MH肉汤作为稀释置换液；设置阳性生长对照、空白培养基阴性对照、无药物持续暴露对照组。
耗材选用透明平底96孔微孔板、疏水透气厌氧封板膜、无菌多通道移液枪；移液枪枪头提前紫外灭菌。
2 仪器预设置与校准
提前24h恒温培养箱稳定至37℃，oCelloScope主机放入培养箱内预热2h。
UniExplorer软件完成光路灰度校准，采集空白培养基BCA基线模板；扫描参数统一设置：Z轴覆盖孔底至液面完整深度，每10μm一层切片，开启SESA静态杂质过滤、动态BCA校正。
扫描间隔设定：整个实验周期每30 min采集一次图像与TA、像素面积数据；总监测时长根据菌株生长特性设置18–24 h。
3 微孔板布局方案（96孔）
外圈全部填充无菌培养基作为蒸发缓冲孔；
处理组：药物短期暴露组（PAE组）；
对照组1：无抗生素阳性生长对照；
对照组2：抗生素持续暴露组；
对照组3：空白无菌培养基阴性对照；
每组设置不少于6个生物学复孔。
三 路线一：原位不开盖稀释法PAE标准操作方案（首选）
1 第一阶段：药物暴露阶段（PAE暴露期，常规2 h）
微孔每孔先加入100 μL标准化菌悬液；
PAE处理孔加入适量抗生素母液，使孔内药物终浓度达到目标测试浓度（常用1×MIC、2×MIC）；
阳性对照孔加入同等体积无菌培养基；
封板膜密封微孔板，低速300 g离心1 min去除气泡；
微孔板放置于oCelloScope板架锁紧，启动时序扫描，持续药物暴露2 h。
软件持续记录暴露阶段菌体像素面积变化。
2 第二阶段：不开盖原位稀释移除药物（核心关键步骤）
暴露时长达到2 h，不取出微孔板、不打开培养箱箱门。
使用带加长吸头的无菌移液枪，透过封板膜预留穿刺区域刺穿封板膜，精准吸取孔内部分菌液；随即快速加入大量无菌MH肉汤，实现孔内抗生素数十倍稀释，将药物浓度降低至远低于MIC，消除持续抑菌作用。
吸液与加样操作控制在30 s以内，尽量减少孔内气相环境扰动；穿刺完成后使用无菌透明密封胶带封堵穿刺孔，防止蒸发与气体交换异常。
全部复孔完成稀释操作后，不移动微孔板位置，仪器继续不间断时序扫描，进入恢复期监测。
3 第三阶段：菌体恢复生长连续监测
持续采集时序图像，直至阳性对照组进入稳定期；全程不取出微孔板，不中断扫描任务。
系统同步输出像素总面积时序曲线与等效TA浊度曲线，原始图像堆栈完整保存，用于区分真实生长与沉淀、结晶干扰。
四 路线二：培养基置换不开盖PAE方案（对稀释体系敏感菌株使用）
1 2 h药物暴露阶段操作同路线一。
2 原位置换操作：穿刺封板膜，小心吸取孔内大部分含药菌液，保留固定体积菌体沉淀，加入等体积无菌MH肉汤轻柔混匀，重复置换一次，最大限度降低孔内抗生素残留浓度。
置换完成密封穿刺口，继续原位不间断扫描监测菌体恢复生长全过程。
该方案稀释倍数更高，药物残留更低，但操作难度更大，需要熟练控制吸取液体体积，避免吸走底层菌体。
五 PAE数值标准化计算方法（基于动力学生长曲线）
1 生长曲线特征点判定
阳性对照组：记录从实验起点至恢复达到特定生长阈值的时间Tc；
PAE处理组（药物短暂暴露后稀释）：菌体经历抑制后重新恢复生长，到达同一生长阈值的时间Tpae；
持续药物暴露组作为参照，确认稀释后无持续抑菌效应。
2 PAE计算公式
PAE（h）= Tpae − Tc
生长阈值统一选取：像素面积达到阳性对照组对数生长期中期固定阈值，保证各组判定标准一致，不使用终点数值。
3 质控剔除标准
阴性基线持续平稳；阳性对照正常出现S型生长曲线；持续给药组全程维持低水平无明显增殖；
复孔PAE数值变异系数大于20%，排查穿刺操作、蒸发、气泡干扰，对应孔数据标记或剔除。
六 数据导出、图表绘制与SCI方法学描述
1 数据导出流程
实验全部结束后备份完整工程；导出CSV时序像素面积、TA数值；批量导出恢复生长关键时间点Z轴堆叠图像。
2 图表建议
图1：各组菌体像素面积时序动力学曲线，标注药物暴露终点、稀释时间点、生长恢复特征点；
图2：各组PAE统计柱状图，标注标准差；
图3：恢复阶段原位成像对比，直观展示菌体形态差异。
3 论文方法学模板
采用oCelloScope原位成像动力学系统开展不开盖连续PAE测定；细菌与抗生素短期共孵育2 h，通过微孔板封板膜穿刺原位无菌培养基稀释，大幅降低孔内抗生素浓度；全程微孔板保留于培养箱内部不取出，Z轴多层时序扫描连续采集菌体像素面积；PAE定义为药物短暂暴露组菌体恢复生长至指定阈值时间减去无药对照组生长时间；SESA图像分割与BCA动态基线校正消除沉淀、气泡干扰，实现抗生素后效应无扰动动态完整测定。
七 实验风险控制与故障处理
穿刺操作容易产生气泡，尽量斜向穿刺，减少液体扰动；
长周期监测注意控制培养箱湿度45%–60%，防止大量冷凝水滴落；
若扫描过程出现短暂通讯卡顿，按照断电接续流程恢复任务，标记扰动时间区间；
穿刺密封不严造成液体大量蒸发，该孔数据直接作废；
优先使用路线一稀释方案，减少菌体损失，提升复孔重复性。