一 筛选体系整体设计思路
依托oCelloScope成像动力学平台搭建标准化高通量抗菌筛选体系，适配植物提取物、挥发精油、中药复方、抗菌多肽四类受试样品。体系融合96孔微孔板高通量排布、Z轴多层时序扫描、成像像素定量+TA等效浊度双指标采集，同步实现初级活性筛选、MIC动力学测定、AUC生长抑制面积定量、菌体形态观测、PAE后效应拓展实验。
整套方案全程可在恒温培养箱内原位监测，无需反复取板；可区分样品抑菌、杀菌、诱导菌体形变、延迟生长等不同作用模式；有效解决精油易漂浮、中药提取物色素干扰、多肽易吸附、菌体沉降导致普通酶标仪定量失真等常见问题。
二 实验前期准备
1 受试样品前处理规范
植物提取物：使用对应溶剂（甲醇、乙醇、DMSO、无菌肉汤）溶解，配置100×母液，0.22 μm滤膜除菌；设置溶剂对照组，排除有机溶剂自身抑菌作用。
精油：采用吐温80无菌水溶液乳化，充分涡旋形成稳定乳浊液，避免精油直接漂浮液面；提前预实验确定乳化剂安全浓度，单独设置乳化剂空白对照。
中药复方：水煎液醇沉处理，过滤除去大分子杂质，除菌过滤；高色素复方必须设置溶剂空白，区分色素吸光干扰与真实菌体生长信号。
抗菌多肽：使用无菌PBS或MH肉汤溶解，避免强酸强碱造成多肽变性；多肽易吸附塑料孔壁，可适当降低孵育前期振荡速度或采用低吸附96孔透明平底微孔板。
所有母液分装避光低温保存，避免反复冻融。
2 菌株活化与菌悬液制备
细菌采用MH肉汤连续传代2次，37 ℃振荡培养至对数生长期；调整终接种浓度5×10⁵ CFU/mL。
真菌采用RPMI 1640培养基，孢子悬液终浓度1×10⁴ CFU/mL；28 ℃培养。
设置标准质控菌株（ATCC标准株）同步筛选，用于批次间数据比对。
3 耗材、仪器前期校准
选用透明平底96孔微孔板，低吸附板优先用于多肽筛选；透气疏水封板膜、无菌多通道移液枪准备到位；微孔板外圈填充无菌培养基作为蒸发缓冲孔，降低边缘效应。
提前24 h稳定外置恒温培养箱，oCelloScope放入箱内预热2 h；UniExplorer完成光路灰度校准，采集空白培养基BCA基线模板；扫描参数固定：Z轴覆盖孔底至液面完整深度，开启SESA静态杂质过滤、动态BCA基线校正，消除色素、药物沉淀、精油乳滴干扰。
扫描间隔：细菌筛选30 min/次，总时长16–20 h；真菌筛选60 min/次，总时长48–72 h。
三 96孔高通量微孔板排布标准化方案
1 孔板布局
外圈A1–A12、H1–H12、B1–G1、B12–G12：无菌培养基缓冲孔。
B2–G11：样品梯度处理区域。
第11列：阳性生长对照（菌液+培养基，无样品）。
第12列：空白阴性对照（无菌培养基，无菌株）。
独立对照组：溶剂对照组、乳化剂对照组（精油实验组）。
2 浓度梯度设置
初级大规模筛选：设置2–3个梯度浓度快速初筛，快速锁定活性样品。
复筛确认实验：采用2倍倍比稀释，设置8个浓度梯度，每梯度不少于4个生物学复孔。
每孔最终体系体积统一100 μL；先加培养基，再加样品母液，最后加入标准化菌悬液，轻柔吹打混匀。
3 封板预处理
全部加样完成后，微孔板300 g低速离心1 min，去除微小气泡；精油实验组重点消除液面气泡与漂浮油滴干扰；密封透气封板膜，膜面无褶皱。微孔板在同温操作台静置30 min平衡温度，减少冷凝水生成。
四 oCelloScope高通量时序扫描标准上机流程
1 将微孔板平稳放置设备板架，卡扣完全锁紧，防止扫描偏移。
2 UniExplorer新建时序扫描任务，导入预设BCA基线模板、Z轴扫描参数。
3 填写实验信息：样品名称、浓度梯度、菌株、培养温度、总监测时长。
4 启动全自动无人值守时序扫描，全程不取出微孔板，维持稳定恒温环境。
5 系统同步记录两项核心定量数据：全深度菌体像素总面积、等效TA浊度；实时保存所有时间点Z轴图像堆栈。
五 多层次数据分级评价体系（初筛→复筛→机理表征）
1 初级高通量筛选指标（快速淘汰无活性样品）
对比阳性对照组生长曲线，定性判断样品是否具备抑制作用；筛选出能明显压低生长曲线的活性样品进入复筛。
筛选指标：延滞期延长程度、最大菌体面积下降幅度。
2 复筛定量指标（活性量化）
指标一：终点动力学MIC，判定可抑制微生物持续增殖的最低样品浓度；区别于传统终点目视法，基于完整时序曲线动态判定。
指标二：AUC生长抑制面积/抑制率，连续量化全程抑菌强度，适合比较不同提取物、多肽的药效强弱，适合高分SCI数据分析。
指标三：比生长速率、延滞期时长，分析样品是延缓生长还是完全抑制增殖。
3 深度机理表征指标（活性样品进一步研究）
调取时序原位图像，观察菌体是否出现丝状化、裂解、团聚、菌丝分枝减少等形态变化。
活性样品可拓展开展不开盖原位PAE抗生素/多肽后效应实验、不同pH/温度条件稳定性筛选。
4 通用质控标准
阴性空白基线平稳无明显上升；阳性对照出现标准S型生长曲线；溶剂对照组与阳性对照无显著差异，证明溶剂无抑菌活性；复孔变异系数控制在15%以内，超过阈值排查气泡、沉淀、样品不均一问题。
六 数据导出、图表与SCI方法学描述
1 数据导出流程
扫描结束后备份完整工程文件；导出UTF-8编码CSV文件，包含像素总面积、TA数值、时间戳；批量导出关键时间点堆叠图像，生成延时视频。
2 推荐图表组合
图1：不同浓度样品菌体像素时序动力学曲线；
图2：各样品AUC生长抑制率柱状统计图；
图3：活性梯度浓度与抑制率拟合曲线，计算AUC₅₀；
图4：代表性时间点原位成像对比，展示菌体/菌丝形态差异。
3 论文方法学标准模板
采用BioSense oCelloScope成像动力学平台构建天然产物高通量抗菌筛选体系；受试植物提取物、精油、中药复方、抗菌多肽进行无菌前处理，96孔板设置浓度梯度、溶剂对照、阳性及阴性对照；依托FluidScope Z轴多层扫描采集微孔全深度时序图像，SESA图像分割算法计算菌体像素总面积，结合等效TA浊度进行双指标定量；动态BCA基线校正消除色素、沉淀、乳滴干扰；通过动态MIC、AUC生长抑制面积综合评价样品抗菌活性，同步获取微生物原位形态时序图像。
七 四类样品专属优化方案
1 植物提取物
重点设置溶剂对照；提取物易析出结晶，依靠SESA静态像素过滤区分结晶与菌体，避免假阳性。
2 挥发精油
必须添加乳化剂，增设乳化剂空白；精油易漂浮液面，Z轴扫描覆盖表层区域，捕捉表层菌体；避免长时间强光照射造成精油氧化。
3 中药复方
高色素样品不依赖单一浊度读数，优先使用成像像素面积作为主要定量指标，规避色素吸光干扰；长时间监测注意药液析出杂质导致基线漂移。
4 抗菌多肽
选用低吸附微孔板；多肽易吸附孔壁造成有效浓度下降，可设置吸附平行对照；关注成像中菌体裂解、球状菌体破损等形态特征。
八 常见故障与优化措施
精油乳化不均产生大量油滴，干扰图像分割，优化乳化涡旋时间与吐温80比例；
中药复方长时间培养析出沉淀，依靠动态基线校正与图像人工复核；
多肽吸附造成活性偏低，更换低吸附微孔板，缩短预孵育时间；
长周期监测冷凝水滴落，提高培养箱湿度控制，封板膜平整密封。