一 实验方案概述与研究目的
复合抗菌制剂由多种活性组分复配而成，组分配比显著影响整体抑菌效果。传统单因素试验、简单棋盘法仅能考察少数组合，无法高效筛选多组分最优配比；正交试验设计能够科学缩减实验组数量，以代表性配比组合覆盖多维配比空间，结合oCelloScope成像动力学平台实现高通量同步评价。
整套方案将正交试验设计与96孔时序原位监测结合，同步获取菌体像素总面积、等效TA浊度动力学数据，依靠AUC生长抑制面积量化抑菌效果，区分组分之间协同、相加、拮抗效应。同时调取原位时序图像观察菌体形态变化，识别最优复配比例，规避单一终点读数带来的假阳性。
体系适用于中药复方、精油复配、多肽-抗生素组合、植物提取物复合制剂等多组分抗菌配方开发，为配方优化提供动力学定量数据支撑。
二 实验前期准备
1 菌株与培养基准备
受试细菌采用MH肉汤连续传代2次，培养至对数生长期，终接种浓度5×10⁵ CFU/mL；真菌采用RPMI 1640培养基，孢子终浓度1×10⁴ CFU/mL。
所有基础培养基统一配制、除菌，保证批次一致性。
2 受试活性组分预处理
各单一活性组分分别配制10×无菌母液，0.22 μm滤膜过滤除菌；设置对应溶剂对照。
依据预实验结果确定每种组分的有效浓度区间，明确正交试验各因子浓度水平，避免浓度过高造成药物大量析出。
3 正交试验水平设计原则
确定影响药效的核心因子（不同抗菌组分A、B、C……）；每个因子设置3～4个浓度水平；选择标准正交表合理安排实验组，大幅减少组合数量。
举例：3个组分，每个组分3个浓度水平，选用L9(3³)正交表，仅9组复配组合即可完成筛选，无需开展全部27种组合测试。
4 仪器校准与扫描参数设置
提前24 h恒温培养箱稳定温度，oCelloScope放入箱内预热2 h；完成光路灰度校准，采集空白培养基BCA基线模板。
扫描参数：Z轴覆盖孔底至液面完整深度，步长10 μm；开启SESA静态杂质过滤、动态BCA基线校正。
扫描间隔：细菌30 min，总时长16–20 h；真菌60 min，总时长48–72 h。所有组别参数保持统一，保障横向对比。
三 96孔微孔板排布与标准化加样流程
1 微孔布局规划
外圈全部填充无菌培养基作为蒸发缓冲孔，降低边缘蒸发效应。
核心区域排布正交试验所有复配组合，每组设置不少于4个生物学复孔。
配套完整对照组：
阳性生长对照：菌液+空白培养基；
阴性空白对照：无菌培养基；
各单一组分对照：相同水平浓度下单一活性物质；
溶剂对照组：菌液+最高浓度溶剂；
无菌药物对照组：各复配体系无菌培养基，用于识别混合组分析出沉淀造成的假阳性。
2 标准化加样顺序
依次加入无菌培养基→各组分母液，轻柔混匀→标准化菌悬液；每孔终体积统一100 μL。
全部加样完成后300 g低速离心1 min去除微小气泡；疏水透气封板膜密封；同温操作台静置30 min平衡温度，减少冷凝水滴落。
四 oCelloScope上机时序扫描操作流程
微孔板平稳放置设备板架，卡扣锁紧，防止扫描偏移。
UniExplorer新建时序扫描任务，载入预设BCA基线模板、Z轴扫描参数，录入正交试验各组配比信息。
启动全自动无人值守时序扫描，全程不取出微孔板，不中断监测。系统持续保存各时间点Z轴图像堆栈、菌体像素总面积、TA浊度时序数据。
实验结束后完整备份工程文件，导出时序数据与图像。
五 数据处理、正交极差分析与药效评价标准
1 动力学指标提取
以菌体像素总面积为主指标，TA浊度作为辅助参考；计算各组AUC生长抑制面积与相对生长抑制率，抑制率越高代表复配体系抑菌效果越强。
2 正交试验统计学分析
对同一因子不同水平下的平均抑制率进行极差分析：极差越大，代表该组分浓度变化对整体药效影响越显著；
通过均值对比，筛选每个组分最优浓度水平，得到理论最优复配配方。
3 结果验证方案
根据正交分析得到的最优配比，额外增设验证实验组，上机重复动力学测试，确认最优配方药效稳定。
4 作用模式辅助判断
调取时序原位图像，观察最优配比体系是否诱导菌体裂解、丝状化；对比单一物质组，区分复配后协同增效、无明显作用、拮抗减效。
六 干扰控制与数据质控要点
1 复配体系沉淀风险防控
多种活性物质混合更容易发生相互作用析出复合物；依靠无菌药物对照组、SESA静态像素过滤区分结晶与活菌；优先使用像素面积作为主要定量依据。
2 一致性控制
所有组别接种浓度、培养条件、扫描参数保持一致，仅改变组分配比单一变量。
3 异常数据剔除
复孔变异系数大于15%，排查气泡、沉淀、加样误差，标记或剔除异常孔数据。