一 实验概述与研究目标

食源性致病菌包含李斯特菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌，生理特性差异明显：李斯特菌可低温生长、易形成生物膜；沙门氏菌存在胞内耐受、应激适应特性；副溶血性弧菌为嗜盐菌，对培养基盐浓度、温度敏感。传统终点MIC仅获得静态数值，难以解析不同致病菌在抗菌物质胁迫下延滞期、增殖速率、菌体形态、复苏能力的动态差异。

依托oCelloScope Z轴多层时序扫描体系，建立统一标准化药敏动力学方案，同步采集菌体像素总面积、等效TA浊度双指标，原位观测菌体丝状化、团聚、裂解等表型。可测定动力学MIC、AUC生长抑制面积、PAE后效应、低温/不同盐浓度下药效变化，对比不同食源性致病菌药敏特征，评估天然产物、消毒剂、抗生素对食源性致病菌防控潜力，适配食品微生物、食品安全抗菌机制相关SCI研究。

二 实验前期准备

1 菌株活化与菌悬液标准化制备

李斯特菌、沙门氏菌采用MH肉汤；副溶血性弧菌使用添加3% NaCl的MH肉汤。所有菌株连续传代2次，振荡培养至对数生长期，消除冻存休眠带来的生理差异。

统一调整菌悬液终浓度5×10⁵ CFU/mL。

副溶血性弧菌全程维持适宜盐浓度，避免渗透压突变造成菌体损伤；李斯特菌可根据实验需求设置4 ℃低温组与37 ℃常温组，模拟冷藏食品环境。

菌株活化阶段不预先接触抗菌物质，防止应激耐受干扰实验结果。

2 培养基、受试抗菌物质配制

受试抗生素、植物提取物、精油、防腐消毒剂配制10×无菌母液，0.22 μm滤膜除菌；设置对应溶剂对照组。

采用2倍倍比梯度稀释，依据预实验MIC设置浓度区间，覆盖完全抑制、部分抑制、无抑制区间。

针对容易析出沉淀的天然产物，提前配制各浓度无菌药物培养基，作为空白对照识别假阳性。

3 仪器校准与扫描参数设置

提前24 h稳定外置恒温培养箱，oCelloScope放入箱内预热2 h；完成光路灰度校准，采集空白培养基BCA基线模板。

扫描参数统一设置：Z轴覆盖孔底至液面完整深度，步长10 μm；开启SESA静态杂质过滤、动态BCA基线校正。

扫描间隔30 min；常温细菌监测时长16–24 h；低温李斯特菌实验组延长监测至48–72 h；全程保存Z轴图像堆栈。

三 96孔微孔板标准化排布

1 布局规范

微孔外圈填充无菌培养基作为蒸发缓冲孔，降低边缘效应。

板内分区：李斯特菌实验组、沙门氏菌实验组、副溶血性弧菌实验组，各组药物梯度完全一致，便于横向药敏对比；每个浓度梯度不少于4个生物学复孔。

2 全套对照组配置（每组致病菌独立配套）

阳性生长对照：标准化菌液+无药培养基；

阴性空白对照：无菌培养基，无菌株；

溶剂对照：菌液+最高浓度溶剂；

无菌药物对照：各梯度药物+无菌培养基，甄别沉淀、结晶干扰。

3 标准化加样流程

加样顺序：无菌培养基→梯度药物母液→对应致病菌菌悬液，轻柔吹打混匀，每孔终体积100 μL。

加样完成后300 g低速离心1 min去除微小气泡；疏水透气封板膜密封；同温操作台静置30 min平衡温度，减少冷凝水滴落。

副溶血性弧菌操作缩短敞口时间，防止盐浓度挥发改变渗透压。

四 oCelloScope上机时序扫描操作流程

微孔板平稳放置设备板架并锁紧卡扣，避免扫描偏移。

UniExplorer新建时序任务，载入预设BCA基线模板、Z轴扫描参数，记录致病菌种类、药物梯度、培养温度、监测时长。

启动全自动无人值守时序扫描，全程不取出微孔板，维持稳定温度、渗透压环境。系统持续保存时序图像、菌体像素总面积、TA浊度数据。

实验结束完整备份工程文件，导出CSV时序数据与关键时间点图像。

五 多层次动力学评价指标与表型判定

1 基础定量指标

动力学MIC：完全抑制致病菌持续增殖的最低药物浓度；

AUC生长抑制面积：连续量化全程抑菌强度，对比三种致病菌药物敏感性差异；

延滞期、最大比生长速率：表征药物延缓增殖能力。

2 药效表型区分（抑菌/杀菌/菌体裂解）

抑菌：曲线长期贴近基线，无持续下降，撤药后菌体可恢复生长，菌体结构完整；

杀菌：菌体持续失活，曲线长期维持低位，长时间无法复苏；

菌体裂解：曲线出现峰值后快速陡降，原位图像观察大量细胞碎片。

3 食源性致病菌专属观测重点

李斯特菌：关注低温条件下药物抑制效果，观测菌体丝状化趋势；

沙门氏菌：重点观察胁迫下菌体团聚、迟发性复苏现象；

副溶血性弧菌：评估盐浓度变化如何影响药物抑菌活性，观察渗透压与药物协同作用。

4 拓展评价方案

可开展不开盖原位PAE实验，评估药物移除后三种致病菌恢复生长能力，评价长效防控潜力；

可增设不同温度、盐浓度梯度，模拟食品加工、冷藏环境，构建药效生态数据。

六 数据处理、图表体系

图1：三种致病菌相同药物浓度下时序动力学对照曲线；

图2：各组AUC生长抑制率统计柱状图；

图3：动力学MIC对比柱状图；

图4：代表性时间点原位成像，对比不同致病菌药物胁迫下形态差异；

图5（可选）：不同温度/盐度条件下药效等高线热力图。

七 专属质控与干扰规避要点

1 副溶血性弧菌渗透压管控

培养基盐浓度严格统一；避免长时间开盖操作，防止水分蒸发升高盐度引发菌体非特异性裂解。

2 低温李斯特菌实验组注意事项

低温下生长速率显著变慢，必须延长总监测时长，不可直接沿用常温终点判读标准。

3 沉淀与沉降干扰

食源性致病菌静置培养易沉降至孔底，依靠Z轴全深度扫描整合底层菌体信号；SESA算法区分药物结晶与活菌，优先采用像素总面积作为主要定量指标。

4 交叉污染防控

更换菌株组别时更换枪头；分区操作，防止不同致病菌交叉污染。

八 拓展实验方向

筛选高效活性物质后，可构建生物膜模型，评估药物对生物膜内包裹致病菌的渗透抑制效果；

开展两种抗菌物质棋盘联用实验，筛选协同配方；

模拟食品基质（蛋白、脂肪）添加，考察有机质存在条件下药效变化。