一 方案概述与合规基础
抗生素敏感性测试（AST）微量肉汤稀释法为中国药典、CLSI M07、ISO 20776-1公认参考方法。药典与标准规定：标准化接种量、阳离子调节MH肉汤CAMHB、35±2 ℃孵育16～20 h，MIC定义为能够完全抑制细菌可见生长的最低抗生素浓度。
常规肉眼判读、终点OD浊度仅能获取终点静态结果；oCelloScope动力学AST方案**完整遵循药典/CLSI操作体系**，培养基、接种浓度、温度、药物梯度全部匹配标准要求，在此基础上增加时序连续监测能力。
方案分为两层：第一层，按照药典标准条件完成16～20 h终点动力学判读，输出与参考方法可比的MIC；第二层，利用全程生长曲线额外获得延滞期、AUC、菌体形态、抑菌/杀菌表型等动力学信息。整套体系可与传统肉汤稀释法做方法比对验证，满足药物研发、抗菌药理、耐药表型研究的数据合规需求。
二 实验前期准备（严格匹配药典、CLSI规范）
1 菌株与菌悬液标准化制备
受试菌株、质控标准菌株（ATCC25922、ATCC29213等）从新鲜琼脂平板挑取3～5个孤立菌落，接种CAMHB肉汤，35±2 ℃振荡培养至对数生长期。
采用0.5麦氏浊度标准校正菌悬液，随后稀释至体系终浓度5×10⁵ CFU/mL，完全符合微量肉汤稀释法接种标准。
每批次试验同步进行活菌涂布计数，验证实际接种浓度落在标准区间；菌株连续传代不超过2次，防止适应性变异。
2 培养基与抗生素配制
使用阳离子调节MH肉汤CAMHB，按照药典要求配制、灭菌；针对特定抗生素（氨基糖苷类、四环素类）严格控制阳离子浓度。
抗生素标准品按照药典方法配制储备母液，0.22 μm滤膜无菌过滤；避光低温保存，避免反复冻融。
采用2倍倍比梯度稀释，梯度范围覆盖临床折点上下区间；预实验确认药物在培养基中无析出、降解。
3 仪器校准与扫描参数设置
提前24 h恒温培养箱稳定至35±2 ℃，oCelloScope整机放入箱内预热2 h；执行光路灰度校准，采集CAMHB空白培养基BCA基线模板。
Z轴扫描覆盖微孔全液体深度，步长10 μm；开启SESA静态杂质过滤、动态BCA基线校正，区分药物沉淀与菌体生长。
扫描间隔30 min；总监测时长统一设置20 h，满足药典最低孵育时长要求；全程保存时序Z轴图像、像素总面积、等效TA浊度。
所有组别扫描参数固定，保证终点判读与动力学分析条件统一。
三 96孔微孔板排布（药典标准AST布局）
1 微孔布局
微孔外圈填充无菌CAMHB作为蒸发缓冲孔，降低边缘蒸发效应。
核心区域：抗生素2倍倍比梯度，每一梯度不少于4个生物学复孔；同步设置质控菌株平行孔。
全套对照组（每块微孔板必须配齐）：
阳性生长对照：标准化菌悬液+无药CAMHB；
阴性空白对照：无菌CAMHB，无菌株；
溶剂对照：菌液+最高浓度抗生素溶剂；
无菌药物对照：各梯度抗生素+无菌CAMHB，识别药物浑浊、结晶干扰。
2 标准化加样顺序（遵循微量肉汤稀释规范）
依次加入CAMHB培养基→梯度抗生素溶液→标准化菌悬液，轻柔吹打混匀，每孔终体积100 μL。
全部加样完成后300 g低速离心1 min去除微小气泡；疏水透气封板膜密封；同温操作台平衡30 min，减少冷凝水滴落。
四 oCelloScope上机时序监测完整流程
微孔板平稳放置板架并锁紧卡扣，防止扫描偏移。
UniExplorer新建时序任务，载入预设BCA基线模板、Z轴扫描参数，录入菌株、抗生素、梯度信息。
启动全自动时序扫描，全程不取出微孔板，维持35±2 ℃稳定环境，连续监测至20 h。
系统持续记录各时间点Z轴堆叠图像、菌体像素总面积、TA浊度时序数据。
实验结束备份完整工程文件，导出时序数据与终点时刻图像，用于MIC判定与动力学分析。
五 符合药典标准的MIC判定规则（终点判读+动力学辅助）
1 终点MIC判定（与药典肉眼判读等效，用于合规比对）
以20 h终点时刻菌体像素总面积作为主要判定依据；阳性对照出现典型S型生长曲线。
MIC定义：20 h终点条件下，能够完全阻止持续菌体增殖、无明显生长信号的最低抗生素浓度，与药典微量肉汤稀释法定义保持一致。
判定阈值：与阳性对照相比，孔内无显著菌体生物量上升；调取终点Z轴图像复核，确认无大量活菌。
2 动力学辅助判读（方法增值信息，不替代终点合规判读）
延滞期时长：评估抗生素延缓菌体生长能力；
AUC生长抑制面积：连续量化全程抑制水平；
生长曲线趋势区分抑菌/杀菌：曲线长期低位、无复苏=抑菌；后期生物量持续下降=杀菌；
时序原位图像观察β-内酰胺类诱导菌体丝状化等特征形态。
3 结果一致性验证要求
动力学终点MIC与传统肉眼微量肉汤稀释MIC允许偏差范围为±1个倍比稀释梯度，符合CLSI方法比对可接受标准；超出偏差梯度需要重复试验。
六 方法验证方案（用于申报、论文合规论证）
1 重复性验证
同一批次微孔板，同一菌株、同一抗生素，复孔MIC结果一致；不同批次试验MIC偏差不超过1个梯度。
2 质控菌株验证
每批次纳入标准ATCC质控菌株，MIC落在CLSI规定质控区间内，作为试验有效前置条件。
3 干扰排除
依托无菌药物对照组、SESA算法消除抗生素结晶、色素带来的假阳性；优先采用像素总面积指标，弥补单纯浊度法缺陷。
七 数据整理、图表与结果报告规范
1 推荐图表组合
图1：不同抗生素浓度菌体像素总面积时序动力学曲线，标注20 h终点；
图2：各菌株动力学MIC汇总柱状图；
图3：阳性对照与临界MIC浓度原位成像对比；
图4：延滞期、AUC生长抑制率统计，展示动力学差异。
2 结果报告规范
正式药敏结论以20 h终点动力学MIC为准，用于敏感/中介/耐药（S/I/R）折点判定，匹配药典与CLSI标准；动力学参数作为机制讨论补充数据，不可单独作为药敏分型依据。
八 常见误差与质控要点
严格控制孵育温度35±2 ℃，温度偏移会直接改变MIC数值；
避免长时间开盖操作，防止抗生素挥发、培养基渗透压变化；
β-内酰胺类药物容易诱导菌体丝状化，图像可见菌体拉长，但仍判定为抑制生长，遵循标准MIC判定逻辑，不将形态畸变误判为生长阳性；
若出现跳孔现象，调取时序图像复核，必要时重复整块微孔板试验。
九 拓展实验方向
获得合规AST MIC结果后，可延伸开展不开盖原位PAE抗生素后效应、时间杀菌曲线、MBC最小杀菌浓度测定，在同一平台完成药效动力学全套数据采集。