一 实验原理与研究目标
细菌在持续亚抑菌药物压力下会发生耐药适应性演化，逐步改变生长速率、延滞期、应激耐受能力，同时伴随菌体形态改变，包括丝状化、膨大、团聚等表型转变。传统研究方式需要多代分批传代、离线取样镜检，批次误差大，无法实现同一压力条件下连续、无扰动追踪；终点MIC只能获知最终耐药水平，缺失演化过程中的动态表型变化。
依托oCelloScope原位时序Z轴多层扫描体系，建立亚抑菌药物压力下连续传代模型，每一代均进行完整动力学监测，同步采集菌体像素总面积时序曲线与原位显微图像。连续追踪多代菌株生长动力学参数与细胞形态演变，阐明耐药演化过程中增殖特征、形态表型、药物耐受水平的时序变化规律，区分短期应激适应与稳定遗传性耐药突变，适配细菌耐药进化、应激适应性相关顶刊研究。
二 实验前期准备
1 菌株准备与基础活化
采用野生敏感亲本菌株，MH肉汤连续传代2次，37 ℃振荡培养至对数生长期，调整菌悬液终浓度5×10⁵ CFU/mL。初始传代前不接触药物，保证起始菌株为敏感野生表型。
2 药物体系与压力浓度设置
依据预实验测定亲本菌株动力学MIC，选取稳定亚抑菌浓度作为持续传代压力，常用1/2 MIC、1/4 MIC区间。药物配制10×无菌母液，0.22 μm滤膜除菌；设置溶剂对照组。
同步准备无药平行传代对照组，排除单纯传代操作带来的自发突变，区分药物诱导适应性与自然演化。
设置无菌药物对照组，识别药物析出沉淀造成图像假阳性干扰。
3 仪器校准与扫描参数设置
提前24 h稳定外置恒温培养箱，oCelloScope放入箱内预热2 h；完成光路灰度校准，采集空白培养基BCA基线模板。
扫描参数：Z轴覆盖孔底至液面完整深度，步长10 μm；开启SESA静态杂质过滤、动态BCA基线校正。
扫描间隔30 min；单代监测总时长16–20 h；全程保存Z轴图像堆栈，用于每一代菌体形态定量分析。所有世代扫描参数保持统一，保障跨代数据横向对比。
三 连续传代操作流程与微孔板排布
1 传代模型设计
设置两大传代组别：
药物压力传代组：亚抑菌浓度药物持续胁迫；
无药平行传代对照组：不含药物，相同传代操作。
持续传代，每一代培养结束后，吸取培养物转接至新鲜培养基（维持对应药物浓度），实现连续压力驯化。传代间隔、转接稀释比例全程固定，保证传代条件标准化。
2 单代96孔微孔板布局
微孔外圈填充无菌培养基作为蒸发缓冲孔。
核心区域：药物亚抑菌浓度处理组、无药对照组，每组不少于4个生物学复孔。
配套对照组：
阳性生长对照（亲本野生株无药培养）；
阴性空白对照：无菌培养基；
溶剂对照；
无菌药物对照。
3 标准化加样流程
每一代转接完成后，按照固定顺序加样：无菌培养基→药物母液→转接后的标准化菌悬液，轻柔混匀，终体积统一100 μL。
加样完毕300 g低速离心1 min去除气泡；疏水透气封板膜密封；同温台面静置30 min平衡温度，减少冷凝水干扰。
四 oCelloScope单代原位时序上机监测流程
微孔板平稳放置设备板架，锁紧卡扣，防止扫描偏移。
UniExplorer新建时序任务，载入预设BCA基线模板、Z轴扫描参数，标注菌株世代、药物浓度。
启动全自动时序扫描，全程不取出微孔板、不中断监测。系统持续采集菌体像素总面积、等效TA浊度、各时间点Z轴堆叠图像。
单代监测结束后，备份工程文件，导出数据；随即吸取菌液按照固定稀释比例转接至下一代新鲜体系，开启新一轮传代与监测。
五 生长动力学与形态追踪评价指标体系
1 生长动力学参数（跨代连续定量）
延滞期时长：观察随传代次数增加，菌株在药物压力下延滞期是否逐步缩短，代表适应性增强；
最大比生长速率：表征菌株在胁迫环境下增殖能力的恢复程度；
AUC生长抑制面积：量化每一代菌株整体受抑制水平，直观体现耐药适应性提升趋势；
动力学MIC：每隔固定世代梯度测定MIC，量化耐药倍数变化。
2 菌体形态演变追踪
选取对数生长期标准时间点图像进行形态统计，观测指标：菌体平均长度、长宽比、圆形度、丝状化菌体占比、菌体团聚程度。
典型演化趋势参考：早期亚抑菌胁迫大量菌体丝状化；持续传代后丝状化比例下降，菌体形态逐步恢复接近野生株，伴随耐药水平上升。
3 演化表型分层判定
短期应激适应：去除药物压力后，耐药表型快速消失，生长与形态恢复亲本特征；
稳定遗传性耐药：即使脱离药物选择压力，耐受水平依旧维持，形态与生长特征稳定改变。
可增设传代终止后的无药复壮实验，区分适应性耐受与稳定突变耐药。
六 数据处理与图表方案
图1：不同世代菌株在亚抑菌药物下像素总面积时序动力学曲线；
图2：延滞期、比生长速率、AUC抑制率随传代代数变化趋势图；
图3：关键世代原位成像对比，展示菌体形态随传代的演变；
图4：各世代动力学MIC变化柱状图，量化耐药提升幅度；
图5：形态参数（长宽比、丝状化比例）跨代变化趋势。
七 实验质控与关键干扰规避
1 传代操作一致性
每一代转接稀释倍数、培养温度、培养时长严格统一，避免操作差异干扰演化结果。
2 污染防控
转接操作无菌化；定期划线分离纯化菌株，监控杂菌污染。
3 沉降与沉淀干扰
依靠Z轴全深度扫描整合底层菌体信号；SESA算法区分药物结晶与活菌，优先采用像素总面积作为核心指标。
4 图像统计标准化
每一代随机选取足量独立菌体开展形态统计，剔除重叠粘连菌体，保证形态参数可靠性。
八 拓展实验方案
筛选代表性演化世代菌株，开展PAE抗生素后效应实验，对比初代敏感株与演化菌株药物移除后的复苏差异；
可设置梯度亚抑菌浓度，比较不同压力强度对耐药演化速度的影响；
可分离演化菌株进行基因组/转录组分析，关联动态生长形态表型与分子机制。