一 实验目的
1 建立基于丹麦BioSense oCelloScope成像法、完全不使用低琼脂半固体培养基的丝状真菌液体培养动态监测标准化实验体系，验证纯液体悬浮培养条件下设备对丝状真菌孢子萌发、芽管伸长、菌丝分枝、菌丝球团聚全过程的自动成像与定量检测能力。
2 规避琼脂基质对菌丝生长延伸、受试药物扩散渗透产生的干扰，获得更贴近工业深层液体发酵、体液感染微环境的真实菌丝生长表型数据。
3 实现96孔板高通量、长时序无人值守连续监测，量化菌丝生长动力学指标与微观形态参数，用于抗真菌药物药效评估、不同菌株生长特性对比、培养条件优劣筛选等科研检测需求。
4 形成一套可重复、参数固定、结果可溯源的无琼脂液体培养上机操作规范，减少人为操作误差，保证组间实验数据具备统计学可比性。
二 实验前期材料与仪器准备
1 菌株与孢子悬液制备
活化目标丝状真菌（曲霉、青霉、镰刀菌、毛霉等），在PDA固体平板25-28℃恒温培养7d，待大量成熟孢子产生后，无菌操作加入无菌0.05%吐温80生理盐水洗脱孢子，经四层无菌纱布过滤去除菌丝碎片，得到纯孢子悬浮液。使用血球计数板计数，梯度稀释至终工作浓度1×10³~1×10⁴个/mL，该接种密度可保证早期孢子单独萌发，便于仪器单根菌丝追踪成像，过高浓度会快速交织成致密菌丝团影响形态参数提取。
2 纯液体培养基配制（无任何琼脂添加）
常规选用PDB马铃薯葡萄糖液体培养基、察氏液体培养基、麦芽汁MEB液体培养基，按照标准配方称量溶解，调节pH至5.5-6.5丝状真菌适宜区间，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却至室温后备用。若开展药物药效评价，培养基提前配制10倍药物母液，0.22μm水系滤器除菌，设置2倍倍比浓度梯度。
3 仪器预调试与参数预设
oCelloScope主机提前放入恒温培养箱内预热2h，完成光路灰度校准与空白液体培养基基线采集；配套UniExplorer分析软件新建任务，预设扫描模式为FluidScope液体深层扫描，开启SESA静态杂质过滤功能，消除培养基微小杂质、药物析出颗粒造成的假阳性信号。扫描Z轴步长设置10μm，覆盖微孔底部至液体液面全部深度；单轮全板扫描时间控制在3min以内，时序拍摄间隔根据实验周期设定，短期萌发监测30-60min/次，长期菌丝球形成监测2h/次；最长可连续不间断监测7d。
4 耗材与对照组设置
采用标准平底96孔细胞培养微孔板，外圈所有孔填充无菌液体培养基作为蒸发补偿孔，防止边缘孔液体挥发导致渗透压改变影响菌丝生长。实验组每梯度设置不少于4个生物学复孔；配套对照组包括：纯液体培养基空白对照组、溶剂对照组、无药物真菌正常生长阳性对照组，若为药效实验增设阳性抗真菌药物对照组。
三 实验操作
1 96孔板无菌加样操作
全程在超净工作台内无菌操作，单孔终体积统一设定为100μL，加样顺序固定为：无菌纯液体培养基→梯度受试药物母液→标准化孢子悬液。加样完成后将微孔板水平放置，300g低速离心1min，彻底去除孔内微小气泡，避免气泡遮挡菌丝成像。使用透气疏水封板膜密封整块板，防止长时间培养水汽凝结滴入培养基造成污染，同时保证孔内有氧交换满足丝状真菌好氧生长需求。封板后将微孔板在操作台室温静置60min，让孢子自然沉降至孔底，保证初始成像可捕捉单个孢子点位。
2 上机装载与软件任务启动
将密封完成的96孔板平稳卡入oCelloScope板架，扣紧固定卡扣避免扫描过程板体轻微位移。打开UniExplorer软件，选择对应板型规格，导入预先设置好的液体扫描参数，勾选图像堆栈存储、生长动力学自动分析、形态学参数量化三个模块，填写菌株名称、培养基类型、培养温度、监测时长等实验信息，确认任务后点击开始全自动时序扫描。整个监测过程无需开盖、无需人工干预，仪器在培养箱恒温环境下连续运行。
3 实验结束数据导出与原始文件备份
全部监测周期结束后，先在软件内终止任务，取出微孔板进行高压灭菌无害化处理。在软件内导出两类核心数据，第一类为动力学量化数据：基于BCA算法的菌丝总像素面积时序曲线、生长抑制AUC曲线、萌发延滞时间、最大生长速率；第二类为成像原始数据：各时间点Z轴最佳聚焦层原位图片、菌丝三维堆叠重建图像，可直观查看孢子出芽、芽管延伸、分枝数量、菌丝球直径、菌丝扭曲断裂形态。所有工程源文件本地备份，防止图像数据丢失。
4 后期补充体外验证实验（可选）
如需进一步完善数据，可在纯液体体系内补充不同pH、溶氧模拟条件的平行板实验，或者在液体培养基中加入胎牛血清模拟体内体液环境，依旧全程不添加琼脂，利用同一套成像参数对比菌丝发育差异，提升数据应用价值。
四 液体培养体系下核心分析指标（UniExplorer软件自动输出）
1 生长动力学定量指标
孢子萌发延迟时间，即从接种到首次检测到芽管凸起的时长；菌丝累积生长面积随时间变化曲线，替代传统OD值，灵敏度远高于酶标仪浊度检测；菌丝生长曲线下面积AUC，用于量化药物整体抑制强度；菌丝最大增殖速率，判断药物是延迟萌发还是直接抑制菌丝延伸。
2 菌丝形态学可视化定量指标
单根菌丝延伸长度、菌丝分枝数量与分枝间距；菌丝球等效直径、菌丝球紧实度、菌丝团占孔内总面积比例；异常形态参数，包括菌丝肿胀、扭曲、空泡化、断裂碎片化比例，用于评价抗真菌药物作用表型。
3 质控判定指标
空白对照组全程无任何菌丝像素信号，阳性对照组菌丝随时间稳定上升，复孔之间动力学曲线重合度偏差小于5%，判定本次液体成像实验数据有效。
五 实验质控关键点与注意事项
1 液体体系菌丝结团干扰控制
96孔板静置培养会自然形成菌丝球，属于丝状真菌液体培养正常表型，仪器依靠多层Z扫描可完整识别菌丝球整体体积，无需通过琼脂固定；若需要减少过度结团，可缩短监测周期至48h以内，仅观测早期芽管与初级分枝阶段。禁止在液体培养基中添加微量琼脂，违背本次纯液体培养方法设定。
2 非特异性信号干扰排除
天然提取物、中药提取物、纳米类抗真菌制剂容易在液体中析出微小沉淀，必须设置药物空白溶剂孔对照，依靠软件SESA杂质过滤算法剔除沉淀像素，仅统计真菌菌丝真实信号，避免动力学数值虚高。
3 环境稳定性控制
培养箱温度波动控制在±0.5℃以内，温度大幅波动会直接影响孢子萌发速率；封板必须选用透气膜，完全密封不透气会造成孔内缺氧，导致丝状真菌生长停滞、形态畸变。
4 数据可比性统一要求
所有菌株、不同药物梯度必须使用完全一致的培养基配方、孢子接种浓度、扫描间隔、Z轴扫描参数，保证组间生长参数可以直接横向对比。