一 实验目的
1 借助丹麦BioSense oCelloScope微生物生长动态监测系统，建立多种单一碳源条件下真菌碳源利用能力高通量筛选体系，通过生长动力学定量结合菌丝形态表型完成双重评价，客观判定受试真菌对各类碳源的同化效率。
2 量化不同碳源对真菌孢子萌发延滞期、生长速率、生物量累积、菌丝分枝程度、菌丝球形成状态的差异化影响，明确菌株偏好碳源、可利用碳源以及无法利用的惰性碳源类型。
3 依托96孔板高通量布局一次性完成十几种碳源平行测试，替代传统单管培养称重、终点镜检、浊度单一点读数等低效方法，形成可重复、数据可量化的碳源代谢表型筛选规范。
4 为真菌代谢生理研究、发酵培养基碳源优化、工业发酵菌种改造、菌株分类鉴定提供标准化定量检测手段。
二 实验前期材料、仪器与前期准备
1 受试菌株与标准化孢子悬液制备
选用曲霉、青霉、镰刀菌、毛霉等丝状真菌，酵母菌可参照本方案同步测试。菌株接种于PDA固体平板，25～28℃恒温培养7d直至产生大量成熟分生孢子。
采用添加0.05%吐温80的无菌生理盐水洗脱孢子，四层无菌纱布过滤去除菌丝团块，血球计数板计数后梯度稀释至终工作浓度1×10³～1×10⁴ CFU/mL。低接种密度能够保证早期孢子单独萌发，便于仪器追踪碳源差异带来的芽管延伸与分枝表型区别，避免高密度菌丝缠绕干扰形态参数统计。孢子悬液冰浴存放，30min内完成加板操作，防止提前萌发导致初始状态不一致。
2 不同单一碳源液体培养基配制
基础培养基采用无碳源察氏液体培养基作为基底，仅保留氮源、无机盐、微量元素，不添加任何葡萄糖、蔗糖等碳水化合物。分别添加等量不同类型单一碳源，可设置葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、淀粉、纤维素、木糖、甘露醇、甘油、果胶等梯度组别，每组独立配制。
所有培养基调节pH至5.5～6.5，121℃高压蒸汽灭菌20min，冷却至室温备用；不添加琼脂，全程纯液体培养，依靠设备FluidScope液体深层扫描模式捕捉悬浮菌丝三维结构。
设置对照组：无碳源空白阴性对照组、葡萄糖正常生长阳性对照组、培养基溶剂对照组。若需要考察复合碳源效应，可增设混合碳源组别。
3 oCelloScope仪器硬件与软件筛选参数预设
将设备整机放置于恒温培养箱内提前预热2h，完成光路灰度校准与空白无碳源培养基基线校正，消除部分碳源不溶性颗粒析出造成的背景噪声。
UniExplorer分析软件新建碳源高通量筛选任务，扫描模式选定FluidScope液体深层Z轴堆栈扫描，开启SESA静态杂质过滤算法，剔除淀粉、纤维素不溶性颗粒的假阳性信号。
Z轴扫描步长设置10μm，完整覆盖微孔底部孢子沉降层至液体表层；单块96孔板单次扫描时长控制在3min以内；时序拍摄间隔设定为1h/次，总监测时长设置72～168h，完整覆盖碳源利用差异带来的生长滞后全过程。
软件开启BCA算法菌丝累积面积自动计算、动力学曲线拟合、形态学参数量化三大模块，可自动输出生长速率、萌发延滞时间、菌丝球尺寸、分枝数量等数据。培养箱温度稳定控制在菌株适宜温度，波动范围≤±0.5℃。
4 耗材排布与生物学重复设置
使用无菌平底96孔细胞培养微孔板，最外圈所有孔填充对应无碳源基础液体培养基作为蒸发补偿孔，避免长时培养边缘孔水分挥发改变渗透压影响生长。
每一种碳源处理组设置不少于4个生物学复孔，单孔终体积统一固定为100μL，保证加样体积误差一致。监测周期超过5天时，使用透气疏水封板膜密封板体，保证有氧呼吸同时减少液体挥发。一块96孔板可一次性排布16种以上碳源，实现高通量并行筛选。
三 实验操作
1 超净台无菌加样与微孔板前处理
全程在二级超净工作台内无菌操作，统一加样顺序：对应单一碳源液体培养基→无菌溶剂（按需添加）→标准化真菌孢子悬液，加样动作轻柔，减少液体震荡产生气泡。
全部孔位加样完成后，将微孔板水平置于离心机内，300g低速离心1min，使孢子均匀沉降至孔底，同时彻底排出孔内微小气泡，防止气泡遮挡扫描光路造成成像缺失。
长周期观测板体使用透气疏水封板膜四边压实密封，室温避光静置60min，等待孢子沉降稳定、液面状态平稳后准备上机。
2 板体装载与高通量筛选任务启动
将密封完毕的96孔板平稳卡入oCelloScope专用板架，扣紧两侧固定卡扣，防止长时间时序扫描过程中板体位移，导致Z轴堆栈图像重建错位失效。
打开UniExplorer软件，选择对应96孔板型号，录入碳源种类、菌株名称、培养温度、扫描间隔、监测总时长等实验信息，勾选时序图像自动存储、生长动力学批量计算、菌丝形态参数导出功能，核对全部参数无误后启动全自动无人值守时序扫描。
整个筛选周期全程不开盖、不挪动微孔板，仪器按照设定间隔自动完成逐层成像、拍照与像素定量分析。
3 监测周期结束与数据分类导出归档
预设监测时长全部结束后，在软件界面终止运行任务，取出微孔板进行高压蒸汽灭菌无害化处理，防止真菌孢子扩散污染实验室环境。
第一类为碳源利用能力动力学数据，包含各组孢子萌发延滞期、菌丝累积生长面积时序曲线、生长曲线下面积AUC、最大生长速率，数值大小直接反映真菌对该碳源的利用效率；第二类为表型成像数据，包含各时间点原位聚焦图片、Z轴三维堆叠重建图像，直观对比不同碳源下菌丝长短、分枝多少、菌丝球致密程度差异。
所有工程源文件、原始图片、数值表格在本地硬盘完整备份，用于后续碳源利用能力排序与表型差异分析。
4 重复性验证补充操作（可选）
使用同一批碳源培养基重复开展整块板筛选试验，保持接种浓度、仪器扫描参数、培养温度完全一致，验证各组生长数据重复性；终点可选取代表性孔位开盖倒置显微镜镜检，与设备成像表型相互比对校验。
四 碳源筛选双维度判定指标
1 生长动力学利用能力指标
萌发延滞期，无法利用碳源组别孢子长期不萌发，可利用碳源延滞期显著缩短；菌丝最大累积面积，面积越高代表碳源同化效率越高；AUC曲线下总面积，作为碳源可利用性综合评分依据；对数期生长速率，区分快速利用碳源与缓慢利用碳源。
2 碳源诱导菌丝表型特征指标
高效利用碳源：菌丝延伸长、分枝茂密、菌丝球体积大且结构疏松；
低效利用碳源：芽管短小、次级分枝极少、仅形成微小致密菌丝球；
不可利用碳源：孢子完全不萌发，无任何菌丝结构产生；
系统可量化菌丝平均长度、单位面积分枝数、菌丝球等效直径，实现表型客观打分。
3 实验数据有效性质控标准
无碳源空白对照组全程无真菌菌丝生长信号；葡萄糖阳性对照组正常萌发且菌丝发育旺盛；同一碳源组别平行复孔动力学数值相对偏差小于5%，判定本次高通量碳源筛选实验数据有效。
五 实验质控关键点与注意事项
1 碳源培养基基底一致性
除单一碳源种类不同外，氮源、无机盐浓度、pH、灭菌条件必须完全统一，仅保留碳源单一变量，避免其他成分差异干扰筛选结果。
2 不溶性碳源杂质信号过滤
淀粉、纤维素等大分子碳源在液体中呈悬浮颗粒状态，必须开启SESA杂质过滤算法，配合空白培养基基线扣除背景，防止颗粒被误判为菌丝生长量，高估碳源利用能力。
3 孢子悬液均一性管控
加板前孢子悬液反复吹打混匀，避免孔间接种量差异造成生长偏差；悬液制备后尽快加板，防止部分孢子提前启动萌发影响延滞期判定。
4 长周期培养环境稳定
多天数监测必须使用外圈蒸发补偿孔+透气密封膜，水分挥发会改变培养基渗透压与碳源有效浓度，导致碳源利用能力判定失真；培养箱减少开门频次，保证温度恒定。