一 实验目的

1 利用丹麦BioSense oCelloScope微生物生长动态监测系统，建立真菌次生代谢产物自抑制效应定量检测方法，通过连续时序成像绘制完整生长动态曲线，量化自身代谢物对孢子萌发、菌丝延伸、生物量累积的内源抑制作用。

2 区分不同添加比例的真菌发酵上清液、粗提次生代谢产物对同源菌株生长延滞期、生长峰值、生长衰退节点的影响，直观表征自抑制引发的菌丝畸形、生长提前停滞等表型。

3 解决传统分光光度法无法区分代谢物色素干扰、菌体碎片干扰，且不能获取形态学佐证的缺陷，构建96孔板高通量梯度加样、全自动无人值守监测的标准化可重复操作体系。

4 为真菌群体密度感应、次级代谢调控、菌种发酵后期自毒机制、发酵周期优化提供客观动力学数据支撑。

二 实验前期材料、仪器与前期准备

1 受试菌株与标准化孢子悬液制备

选用曲霉、青霉、镰刀菌、链格孢等易大量合成次生代谢产物的丝状真菌，在PDA固体平板25～28℃恒温培养7d，获得足量成熟分生孢子。

采用0.05%吐温80无菌生理盐水洗脱孢子，四层无菌纱布过滤去除菌丝团块，血球计数板计数后稀释至工作浓度1×10³～1×10⁴ CFU/mL。低接种密度可保证早期单孢子独立萌发，便于精准捕捉低浓度自抑制物带来的萌发延迟差异，避免高密度菌体自身快速产代谢物造成初始抑制干扰。孢子悬液冰浴存放，30min内完成加板操作。

2 次生代谢自抑制底物与培养基配制

基础液体培养基采用PDB或察氏液体培养基，121℃高压灭菌20min冷却备用，全程纯液体培养，不添加琼脂，依靠设备FluidScope液体深层扫描模式对悬浮菌丝球进行三维成像定量。

制备同源真菌发酵上清液作为自抑制受试物：将目标真菌液体摇瓶培养5～10d，无菌条件下8000r/min离心10min，0.22μm滤膜过滤除菌，去除菌体仅保留含次生代谢产物的上清液；如需浓缩效应，可采用真空低温浓缩得到粗代谢产物浸膏，再用基础液体培养基复溶过滤除菌。

设置体积分数梯度，例如0%、10%、20%、40%、60%、80%发酵上清液添加组，以基础培养基补足单孔体系体积；配套对照组设置：空白培养基对照组、无菌发酵空白培养液对照组、未添加代谢物的真菌正常生长阳性对照组、溶剂对照组。

3 oCelloScope仪器硬件与软件参数预设

设备整体放入恒温培养箱提前预热2h，完成光路灰度校准、空白培养基基线扫描，消除发酵上清液中色素、微量悬浮颗粒造成的背景干扰。

UniExplorer软件新建自抑制动力学监测任务，扫描模式选择FluidScope液体Z轴堆栈扫描，强制开启SESA静态杂质过滤算法，过滤代谢物析出沉淀、培养基微量不溶物的假阳性像素信号。

Z轴扫描步长设定10μm，完整覆盖微孔底部孢子沉降层至液体液面；单板单次扫描时长控制在3min以内；时序拍摄间隔设置1h/次，总监测时长72～168h，完整记录正常生长、自抑制延缓生长、后期生长受抑停滞全过程。

软件开启BCA算法菌丝累积面积自动计算、生长曲线自动拟合、AUC面积计算、萌发延滞时间判定模块，同步开启形态参数统计功能，用于统计自胁迫下菌丝肿胀、断裂、分枝减少等异常比例。培养箱温度稳定设置25～28℃，温度波动控制在±0.5℃以内。

4 耗材与分组重复设置

使用无菌平底96孔细胞培养微孔板，最外圈所有孔填充基础液体培养基作为蒸发补偿孔，避免长周期培养边缘孔水分挥发改变代谢物浓度。

每一个代谢产物添加梯度设置不少于4个生物学复孔，单孔终体积统一固定为100μL。监测时长超过5d时，采用透气疏水封板膜密封整块板，保证有氧代谢同时最大程度减少液体挥发导致自抑制物浓度被动升高。

三 实验操作

1 超净台无菌加样与微孔板预处理

全程在二级超净工作台内完成无菌加样，固定加样顺序：基础液体培养基→不同比例同源真菌发酵上清液/代谢粗提物→标准化真菌孢子悬液，加样过程轻柔吹打，避免产生大量气泡。

全部孔位加样完成后，将微孔板水平放入离心机，300g低速离心1min，使孢子均匀沉降至孔底，同时彻底排出孔内微小气泡，防止气泡长期遮挡扫描光路导致局部生长数据缺失。

需要长期监测的板体，使用透气疏水封板膜四边完全压实密封，室温避光静置60min，等待孢子沉降稳定、液面状态平稳后准备上机。

2 板体装载与生长动态监测任务启动

将密封完毕的96孔板平稳卡入oCelloScope专用板架，扣紧两侧固定卡扣，防止多轮时序扫描过程中板体轻微位移，造成Z轴图像堆栈重建错位失效。

打开UniExplorer软件，选定对应96孔板型号，录入菌株名称、代谢物添加梯度、培养温度、扫描间隔、总监测时长等实验信息，勾选时序图像自动存储、菌丝生长动力学连续计算、曲线自动导出全部功能，核对所有参数无误后启动全自动时序扫描。

整个监测周期保持培养箱关闭、微孔板不取出、不开盖操作，仪器按照预设间隔自动完成逐层成像与像素定量，连续绘制各组完整生长动态曲线。

3 实验终止与数据分类导出归档

预设监测周期全部结束后，在软件端终止运行任务，取出微孔板进行高压蒸汽灭菌无害化处理，避免活菌与孢子扩散污染环境。

第一类为生长动态曲线量化数据，系统自动导出各组随时间变化的菌丝累积面积数值，直接生成连续生长曲线，同时输出萌发延滞时长、最大生长量、曲线下AUC面积、生长抑制率、生长停滞出现时间等自抑制核心参数；第二类为成像原始数据，导出各时间点原位聚焦图片与三维堆叠重建图像，直观对比高浓度次生代谢产物造成的菌丝短小、分枝匮乏、菌丝球发育受阻等自抑制表型。

所有工程源文件、原始图片、数值数据表在本地完整备份，用于后续自抑制效应强度统计与曲线差异分析。

4 平行验证补充操作（可选）

使用同一批次发酵上清液重新配制梯度开展重复板试验，保持接种浓度、仪器扫描参数、培养温度完全一致，验证生长抑制曲线重复性；终点可选取典型梯度孔开盖镜检，与设备成像形态进行比对佐证。

四 自抑制效应核心判定指标

1 生长动态曲线定量指标

孢子萌发延滞期，自抑制物浓度越高延滞时间越长；菌丝最大生长峰值，内源代谢物抑制组最大生物量显著低于阳性对照组；生长曲线下AUC总面积，作为自抑制强度量化依据；生长平台期提前下降节点，代表代谢物累积达到毒性阈值引发生长衰退。

2 自抑制特异性形态表征指标

低浓度代谢物仅表现为生长速率小幅下降，菌丝形态无明显异常；中高浓度自抑制条件下，芽管伸长受阻、次级分枝数量大幅减少、菌丝球体积偏小且结构致密；高浓度出现菌丝空泡化、肿胀扭曲、断裂碎片化等毒性损伤表型。

3 数据有效性质控判定标准

空白培养基对照组全程无任何菌丝生长像素信号；0%代谢物阳性对照组生长曲线正常上升并平稳进入平台期；同一梯度复孔生长曲线重合度相对偏差小于5%，判定本次自抑制生长动态测定数据有效。

五 实验质控关键点与注意事项

1 发酵上清液彻底除菌处理

次生代谢产物粗提液必须经0.22μm滤膜两次过滤，杜绝残留活菌在测试孔内二次生长，干扰目标菌株真实生长曲线，造成自抑制结果假阳性。

2 色素与颗粒背景信号扣除

真菌发酵上清液多带有天然色素，部分代谢物长时间放置会析出微小颗粒，必须全程启用SESA杂质过滤算法，搭配空白培养液基线校正，避免色素与沉淀被统计为菌丝面积，高估实际生长量。

3 单一变量严格把控

仅改变同源代谢产物添加比例，培养基pH、碳氮源、培养温度、孢子接种浓度全部保持一致，排除环境胁迫叠加干扰自抑制效应判断。

4 长周期浓度稳定性控制

长时间密闭培养必须使用外圈蒸发补偿孔，液体挥发会导致孔内代谢产物浓度被动浓缩，人为放大自抑制效果，造成动力学曲线失真。