一 实验目的
1 依托丹麦BioSense oCelloScope微生物生长动态监测系统，建立96孔微孔板液体/半固体体系下霉菌单菌落径向扩展速率全自动测量标准化方案，替代人工标尺测量、图片软件手动圈选等误差较大的传统方法，实现长时间连续、无人值守自动测算。
2 通过设备时序堆叠成像与内置图像算法，逐时间点自动识别微孔内霉菌菌落边界，连续计算菌落直径、面积、径向扩展长度，拟合线性扩展速率曲线，量化不同菌株、药剂胁迫、环境条件对菌落蔓延速度的影响。
3 区分液体体系菌丝球三维扩张与低浓度琼脂半固体平板二维平面菌落扩散两种形态，形成统一可复现的参数设置与判定规则，用于抗霉菌药剂药效评价、菌株生长能力对比、环境胁迫对菌落蔓延抑制效应研究。
4 全程记录菌落从单点萌发、圆形菌落向外辐射扩展、后期相互融合的完整过程，自动输出扩展速率动力学参数，保证数据客观性与可溯源性。
二 实验前期材料、仪器与前期准备
1 试验菌株与单点孢子接种物制备
受试菌株选用曲霉、青霉、镰刀菌、毛霉等丝状霉菌，PDA固体培养基25～28℃培养7d获得成熟孢子。
采用0.05%吐温80无菌生理盐水洗脱孢子，四层无菌纱布过滤去除菌丝团，血球计数板计数后稀释至极低浓度10～50个/mL，该稀释度可保证96孔每孔仅落入单个孢子，实现单点单菌落生长，避免多菌落叠加融合干扰扩展直径测量。孢子悬液冰浴放置，30分钟内完成加板，防止提前萌发。
2 培养体系配制（两种可选体系）
第一种为低琼脂半固体体系，适合二维平面菌落扩展测量：PDB液体培养基添加0.2%～0.4%低熔点琼脂糖，加热溶解后调节pH至5.5～6.5，121℃高压灭菌20min，温度降至45℃左右进行铺板加样，凝固后霉菌在凝胶表层平面向外辐射生长，菌落呈规则圆形，便于系统识别径向半径。
第二种为纯液体悬浮体系，适合菌丝球三维体积扩展测量：直接使用PDB或察氏液体培养基，灭菌冷却后使用，霉菌沉降于孔底形成圆形菌丝球，系统通过Z轴多层扫描测算菌丝球等效直径与体积扩张速率。
若开展药物抑制试验，提前配制受试药物母液经0.22μm滤器除菌，在培养基凝固前按比例加入混匀；设置空白培养基对照组、溶剂对照组、无药物正常生长阳性对照组。
3 oCelloScope仪器硬件与菌落测量专属软件参数预设
将设备放置于恒温培养箱提前预热2h，完成光路灰度校准、空白培养基基线扫描，消除琼脂凝固析出颗粒、培养基杂质背景干扰。
UniExplorer软件新建菌落扩展速率测量任务，半固体二维菌落选用常规透射扫描模式，液体菌丝球选用FluidScope液体深层Z轴堆栈扫描模式，统一开启SESA静态杂质过滤算法，剔除凝胶颗粒、药物结晶造成的假边界信号。
Z轴扫描步长设置10μm，半固体体系聚焦凝胶表层平面即可，液体体系全覆盖孔底至液面；单块96孔板单次扫描时长控制在3min以内；时序拍摄间隔设置2h一次，总监测时长根据菌株扩展速度设定为5～14天，保证完整捕捉菌落持续向外扩展全过程。
软件开启菌落自动轮廓识别模块、面积自动计算模块、直径线性拟合模块，系统可自动标记菌落边缘，计算每一个时间点等效圆直径、径向扩展距离，自动拟合时间-直径线性方程得到扩展速率μm/h或mm/d。培养箱温度稳定控制在25～28℃，温度波动≤±0.5℃。
4 耗材设置与分组排布
采用平底透明96孔细胞培养微孔板，保证底部透光性满足透射成像识别菌落边界。微孔板最外圈所有孔填充对应培养基作为蒸发补偿孔，防止长周期培养边缘孔水分挥发导致琼脂脱水开裂或液体渗透压改变，造成菌落生长异常。
每个处理组设置不少于4个生物学复孔，单孔终体积统一100μL。超过5天长周期监测使用透气疏水封板膜密封微孔板，兼顾气体交换与水分锁止，避免冷凝水滴落破坏菌落形态。单块96孔板可一次性完成多菌株、多药物浓度、多培养条件平行测试。
三 实验操作
1 超净台无菌加样与微孔凝固处理
全程在二级超净工作台内无菌操作，低琼脂半固体体系需在培养基45℃不烫手状态下快速加样，加样顺序为半固体培养基→药物/溶剂→极低浓度孢子悬液，轻柔吹打混匀避免琼脂局部凝固结块。纯液体体系直接按照培养基、药物、孢子悬液顺序添加。
全部孔位加样完毕后，微孔板水平放置，300g低速离心1min，半固体体系使单个孢子沉降嵌入凝胶表层，液体体系让孢子沉降于孔底，同时排出孔内气泡，防止气泡遮挡菌落边界造成轮廓识别不全。
半固体体系置于室温静置30min等待琼脂完全凝固，之后使用透气疏水封板膜压实密封整块板，室温避光静置60min，等待孢子位置完全固定。
2 板体装载与菌落自动测量任务启动
将密封完成的96孔板平稳卡入oCelloScope专用板架，扣紧两侧卡扣，防止长达数天连续扫描过程中板体位移，导致不同时间点图像无法精准对齐，影响菌落轮廓差分计算。
打开UniExplorer软件，选定对应96孔板型号，录入菌株名称、培养体系类型、培养温度、扫描间隔、总监测时长等信息，勾选时序图像自动存储、菌落边缘自动勾勒、直径自动测算、扩展速率线性拟合、数据批量导出全部功能，核对参数无误后启动全自动时序扫描。
整个监测周期全程不开盖、不触碰微孔板，仪器按照设定间隔自动拍照、识别菌落边界、计算扩展参数，实现菌落扩展速率无人值守自动测量。
3 实验结束终止任务与数据导出归档
预设监测周期全部结束后，在软件界面终止扫描任务，取出微孔板进行高压蒸汽灭菌无害化处理，防止霉菌孢子扩散污染。
第一部分导出定量测量数据：每个时间点菌落等效直径、菌落投影面积、单位时间径向扩展长度、线性拟合扩展速率值、扩展阻滞延滞期，不同组别速率可直接进行统计学对比；第二部分导出成像文件：各时间点原位实拍图片、软件自动圈画的菌落轮廓标记图、Z轴三维重建图像，直观查看菌落圆形度、边缘毛刺、药物胁迫下不规则畸形扩展形态。
所有工程源文件、原始图片、数值表格本地完整备份，用于后续扩展能力差异分析。
四 自动测量判定指标与数据质控标准
1 菌落扩展核心定量指标
瞬时扩展速率，相邻两个扫描时间点之间菌落半径增加量除以时间间隔；平均线性扩展速率，全程时间-直径拟合直线斜率，作为菌株本底扩展能力核心评价指标；最大扩展半径，微孔空间限制前菌落可达到的最大直径；扩展延滞期，从单点孢子萌发到菌落开始向外辐射蔓延的时间。
2 形态辅助判定指标
正常菌落：半固体中呈规整圆形，边缘光滑，扩展速率稳定线性上升；胁迫抑制菌落：圆形度下降、边缘褶皱扭曲、扩展速率显著降低甚至停滞；高密度融合菌落：相邻菌落边界接触后扩展速率骤降，系统可自动标记融合时间点。
3 数据有效性质控判定标准
空白对照组无任何菌落轮廓信号；阳性对照组单菌落规则圆形稳定向外扩展；同一组别复孔平均扩展速率相对偏差小于5%，判定本次自动测量实验数据有效。
五 实验质控关键点与注意事项
1 单孢子单点接种严格把控
孢子稀释浓度过高会出现一孔多菌落，相互融合导致系统无法单独测算单菌落扩展速率，必须预实验确认每孔单点萌发概率，保证绝大多数微孔仅生长单个菌落。
2 半固体琼脂浓度统一
琼脂浓度过低凝胶过软，菌落容易下陷无法平面扩散；浓度过高质地过硬直接抑制蔓延，整板琼脂添加比例必须完全一致，消除基质硬度带来的速率偏差。
3 菌落边界干扰信号剔除
培养基琼脂颗粒、药物析出沉淀极易被软件误识别为菌落边缘，必须全程开启SESA杂质过滤，依靠空白孔基线扣除背景，仅将霉菌菌丝致密团块作为有效菌落区域。
4 长周期环境稳定性管控
外圈蒸发补偿孔不可省略，半固体体系脱水会造成凝胶收缩、菌落挤压变形；培养箱减少开门频次，温度波动会直接改变霉菌代谢速度，造成扩展速率测量失真。