一 实验目的

1 依托丹麦BioSense oCelloScope微生物生长动态监测系统，建立两种及以上防霉剂复配体系对霉菌抑制效果的高通量动力学评价标准化方法，定量判定复配组合表现为协同增效、相加作用还是拮抗作用。

2 通过时序连续成像记录单剂、不同配比复配药剂下目标霉菌孢子萌发延滞期、菌丝生长速率、生物量累积曲线、菌丝形态损伤程度，依靠完整生长动力学数据计算抑菌效应指数，客观量化复配协同强度。

3 利用96孔板高通量排布一次性完成多种单药、多组复配比例、多浓度梯度平行测试，替代传统单点MIC对比法只能终点判定的局限性，明确最优复配配比与长效抑制能力，为粮食、果蔬、饲料防腐配方开发提供可重复的动力学依据。

4 形成变量严格可控、仪器参数统一、结果可溯源的复配药剂筛选操作规范，消除人工判读误差与浊度法基质干扰问题。

二 实验前期材料、仪器与前期准备

1 试验菌株与标准化孢子悬液制备

选取黄曲霉、黑曲霉、青霉、镰刀菌等仓储污染常见霉菌作为受试菌株，在PDA固体培养基25～28℃恒温培养7天，直至平板产生大量成熟分生孢子。

采用添加0.05%吐温80的无菌生理盐水冲洗孢子，四层无菌纱布过滤去除菌丝团块，血球计数板计数后稀释至终工作浓度1×10³～1×10⁴ CFU/mL，低接种密度便于仪器捕捉低浓度复配药剂对孢子早期萌发的阻滞差异，避免高密度孢子抱团干扰形态参数统计。孢子悬液冰浴暂存，30分钟内完成加板，防止提前萌发造成初始状态不一致。

2 防霉剂单剂与复配梯度体系配制

基础液体培养基选用PDB马铃薯葡萄糖液体培养基，121℃高压蒸汽灭菌20min冷却备用，全程纯液体培养不添加琼脂，依靠设备FluidScope液体深层Z轴堆栈扫描对悬浮菌丝球进行成像定量。

选取两种或多种常用防霉剂，分别用无菌水或DMSO配制成高浓度母液，经0.22μm对应滤器过滤除菌。先对每种单药进行二倍倍比稀释确定单独MIC值，再基于MIC设置不同体积比复配组合，例如1:9、3:7、5:5、7:3、9:1等配比，同时设置复配总浓度梯度。体系内有机溶剂最终体积分数控制在1%以内，避免溶剂本身产生抑菌干扰。

试验分组设置：空白培养基对照组、药剂溶剂对照组、各防霉剂单药浓度梯度组、不同比例复配药剂组、无药剂霉菌正常生长阳性对照组。单孔最终反应体积统一设定为100μL。

3 oCelloScope仪器硬件与动力学评价参数预设

将整套设备放置于高精度恒温培养箱内部，提前2小时开机完成光路灰度校准、空白培养基基线扫描校正，消除脂溶性药剂析出结晶、培养基不溶性颗粒带来的背景假阳性信号。

UniExplorer软件新建复配防霉剂协同动力学评价任务，扫描模式选定FluidScope液体Z轴多层堆栈扫描，强制开启SESA静态杂质过滤算法，剔除药剂析出颗粒、代谢沉淀的干扰像素。

Z轴扫描步长固定为10μm，完整覆盖微孔底部孢子沉降层至液体液面全部深度；单块96孔板单次完整扫描时长控制在3分钟以内；时序拍摄间隔设定为30分钟一次，总监测时长设置72～168小时，高频采集捕捉萌发延滞期差异，完整记录对数生长期抑制、后期是否出现生长反弹等动力学全过程。

软件启用BCA算法自动计算菌丝累积生长面积、拟合生长曲线、计算曲线下AUC面积、萌发延迟时间、最大生长速率，同时开启形态学量化模块，统计菌丝长度、分枝数量、畸形菌丝占比用于辅助判断损伤程度。培养箱恒定温度设置26℃，全程温度波动控制在±0.5℃以内。

4 耗材排布与生物学重复设置

使用无菌平底96孔低吸附聚苯乙烯微孔板，降低霉菌菌丝贴壁附着对成像的影响。微孔板最外圈所有孔填充无菌PDB液体培养基作为蒸发补偿孔，防止长周期培养边缘孔水分挥发导致药剂浓度被动浓缩，造成复配效应判定失真。

每一个单药浓度、每一组复配配比均设置不少于4个生物学复孔，保证统计学可靠性。监测周期超过5天的板体使用透气疏水封板膜整体密封，满足霉菌有氧呼吸需求的同时减少水分散失与外界杂菌污染。单块96孔板可同时排布多种单剂、十余组复配比例，实现高通量并行评价。

三 实验操作

1 超净台无菌加样与微孔板预处理

全程在二级超净工作台内完成无菌加样操作，统一固定加样顺序：PDB液体培养基→单药/复配防霉剂工作液→标准化霉菌孢子悬液，加样动作轻柔，减少液体震荡产生气泡。

全部孔位加样完成后，将微孔板水平放入离心机，300g低速离心1分钟，使霉菌孢子均匀沉降至微孔底部，同时彻底排出孔内微小气泡，避免气泡遮挡扫描光路造成局部生长数据缺失。

长周期监测的板体使用透气疏水封板膜四边完整压实密封，杜绝缝隙漏气失水，密封完毕后在室温避光环境静置60分钟，等待孢子沉降稳定、液面状态平稳后准备上机。

2 板体装载与高通量动力学监测任务启动

将密封完成的96孔板平稳卡入oCelloScope专用板架，扣紧两侧固定卡扣，避免多天连续时序扫描过程中板体位移，导致Z轴堆栈图像无法精准重建。

打开UniExplorer分析软件，选择对应96孔板型号，录入防霉剂种类、复配比例、浓度梯度、培养温度、扫描间隔、总监测时长等试验信息，勾选时序图像自动存储、菌丝动力学参数批量计算、生长抑制率自动统计、形态数据导出全部功能，核对参数无误后启动全自动无人值守时序扫描。

整个评价周期全程不开盖、不挪动微孔板，仪器按照预设间隔自动完成逐层成像、图像保存与像素定量分析，连续记录各组完整生长动态曲线。

3 监测结束任务终止与数据分类导出归档

预设监测周期全部运行完毕后，在软件界面终止扫描任务，取出微孔板进行121℃高压蒸汽灭菌无害化处理，防止霉菌活性孢子扩散污染实验室。

第一部分导出动力学定量评价数据，包含各组孢子萌发延滞时长、菌丝面积时序增长曲线、AUC抑制率、最大生长量，依据单药与复配组生长抑制水平计算协同系数，判定协同、相加或拮抗作用，同时导出各组MIC数值；第二部分导出成像原始文件，包含各时间点原位聚焦图片、Z轴三维堆叠重建图像，直观对比复配药剂协同作用下菌丝严重肿胀断裂、几乎无分枝等更强损伤表型。

所有软件工程源文件、原始图片、数值统计表在本地完整备份，用于复配配方效能分析与最优比例筛选。

四 复配协同作用判定指标与评价规则

1 动力学定量评价指标

萌发延滞期延长幅度，协同复配组孢子阻滞时间显著长于同等总浓度单药组；生长曲线下AUC抑制率，复配组抑制率明显高于单药抑制率加和则判定为协同增效；最大菌丝生物量，协同体系可将菌丝生长峰值压制在更低水平；后期生长反弹情况，协同复配具备更持久的抑制效果，不易出现后期霉菌恢复生长。

2 形态学辅助佐证指标

单一防霉剂亚抑菌浓度：仅表现为生长速率小幅下降，菌丝形态基本完整；

复配协同体系同等总浓度：芽管伸出严重受阻，菌丝短小、大量空泡化断裂、无法形成正常菌丝球，损伤程度远大于单剂作用叠加效果；

拮抗组合：复配组抑制效果弱于任意一种单药，菌丝发育接近正常阳性对照组。

3 数据有效性质控判定标准

空白培养基对照组全程无线性菌丝像素信号；无药剂阳性对照组霉菌正常萌发并形成完整菌丝球；同一配比复配组平行复孔动力学曲线相对偏差小于5%，判定本次高通量动力学评价数据有效。

五 实验质控关键点与注意事项

1 复配浓度总量严格统一

对比不同配比复配组时，各组药剂总有效成分浓度必须保持一致，仅改变两种药剂比例，保证变量只有复配比例单一因素，否则无法客观判定协同效应。

2 药剂析出信号强制过滤

多种防霉剂复配后溶解度可能下降，容易析出微小结晶颗粒，必须全程开启SESA杂质过滤算法，搭配溶剂空白孔扣除背景，避免结晶被误计为菌丝生长量，低估复配抑菌效果。

3 接种与培养条件完全一致

所有单药组、复配组孢子接种浓度、培养基pH、培养温度、扫描间隔全部统一，排除环境胁迫叠加干扰复配真实作用判定。

4 长周期浓度稳定性管控

超过7天的监测必须使用外圈蒸发补偿孔+密封透气膜，水分挥发会造成孔内药剂浓度被动升高，人为放大抑制效果，导致协同系数计算出现偏差。