光合厌氧细菌生长依赖厌氧环境与特定光照条件，常规检测方式需要反复开盖取样，氧气侵入会抑制菌体代谢，同时光照条件难以精准统一。oCelloScope时序成像系统配合密闭微孔培养体系，全程无需揭盖，结合可控光源模块，同步调控光照强度、光暗周期，依靠Z轴倾斜堆叠成像实现无标记连续观测。可以动态记录光合细菌增殖、菌体聚团、色素形成过程，定量生长动力学参数，适用于光合细菌逆境筛选、碳源利用、光环境调控等高通量实验。

二、标准化微孔实验操作流程

1. 微孔体系厌氧制备

选用96孔平底微孔板，培养基提前煮沸除氧，持续通入高纯氮气去除溶解氧。培养基分装、菌株接种全部在厌氧工作站内完成。接种完成后使用高阻氧透光封板膜密封微孔板，消除大气氧气持续渗透。设置空白培养基对照、有氧对照组作为参照，每组设置3~4个生物学重复。长周期监测选用适配密封膜，减少水分蒸发，防止孔内渗透压升高。

2. 光照与培养参数配置

仪器配套光照模块开启，根据菌株需求设置光照强度、波长、光暗交替周期；全程保持恒温。根据菌株特性选择静态培养，低速间歇振荡可按需启用，缓解光合菌体沉降堆积。时序图像采集间隔设置30~90 min，总监测周期依据光合细菌生长速率设定。开启Z轴堆叠成像，捕捉悬浮菌体；固定曝光、增益参数，保障不同组别数据横向对比一致性。

3. 密闭体系质控要点

微孔板转运过程尽量缩短在大气中的暴露时间；密封完成后可搭配厌氧指示剂长期验证体系气密性；避免频繁移动微孔板，防止光路偏移与扰动菌体。

三、UniExplorer软件数据分析策略

1. 算法选择

SESA算法：统计光合细菌投影总面积，构建生长动力学曲线，替代传统OD检测；

SEAL算法：单细胞分割，统计菌体粒径、细胞聚团尺寸，观测菌体聚集行为。

2. 核心定量指标

动力学指标：生长延滞期、最大生长速率、稳定期生物量；

形态指标：菌体聚团占比、平均细胞团直径；

配套分析：对比不同光强、碳源条件下光合细菌增殖差异。

3. 数据降噪处理

利用空白孔扣除培养基杂质、气泡背景信号；区分菌体聚团与培养基沉淀，剔除异常噪点数据。

四、常见实验干扰与优化对策

1. 氧气渗透抑制生长：选用高阻氧透光封膜，缩短大气环境转运时长；

2. 光照不均造成组间误差：微孔板居中放置，保证各个微孔受光均匀；

3. 菌体沉降聚集：启用间歇低速振荡，成像前短暂静置稳定视野；

4. 冷凝水滴落干扰成像：维持仪器内部温度稳定，减小温差产生冷凝水。

五、论文材料方法标准英文描述

Time-lapse monitoring of anaerobic phototrophic bacteria was carried out using the oCelloScope imaging system. Medium preparation, inoculation and plate sealing were completed in an anaerobic workstation to maintain anoxic conditions. The 96-well microplate was sealed with oxygen-barrier transparent film without uncovering during incubation. The built-in light module was set to required light intensity and light-dark cycle. Sequential Z-stack tilted images were captured at fixed intervals. The SESA algorithm in UniExplorer software was used to quantify bacterial projected area for growth kinetics analysis. At least three biological replicates were arranged for each treatment.

中文释义：

采用oCelloScope成像系统开展厌氧光合细菌时序监测。培养基配制、接种、封板操作均在厌氧工作站内完成，维持厌氧环境。96孔微孔板使用阻氧透光膜密封，培养全程不揭盖。仪器内置光源模块设置目标光照强度与光暗周期，按照固定间隔自动采集Z轴倾斜堆叠图像。利用UniExplorer软件SESA算法定量细菌投影面积，开展生长动力学分析。每组处理设置至少三组生物学重复。

六、适用研究场景

不同光环境调控光合细菌生长、有机碳源筛选、厌氧光合细菌重金属耐受测试、光合抑菌物质活性评价、光合菌群共生动态观测。