溶菌酶通过破坏细菌肽聚糖细胞壁引发菌体裂解。传统OD浊度检测仅能反映光密度变化，无法区分菌体裂解、细胞团聚、菌体自溶，难以直接证实溶菌酶引发的细胞破碎。oCelloScope采用倾斜光路Z轴堆叠无标记时序成像，持续追踪溶菌酶作用下细菌形态变化，依托图像分割算法区分完整菌体与裂解碎片，定量裂解启动时间、裂解速率、残存活菌水平，构建溶菌酶杀菌动力学曲线，实现溶菌酶浓度筛选、环境因子影响、细菌耐受性评价等高通量测试。

二、标准化微孔实验操作流程

1. 微孔体系搭建

选用96孔微孔板，设置实验组：细菌+梯度浓度溶菌酶；对照组：纯细菌阳性组、空白培养基组。统一细菌初始接种浓度，消除初始菌量带来的数据偏差。每组设置3~4个生物学重复。

溶菌酶作用敏感菌株前期预实验确定监测时长，革兰氏阴性、革兰氏阳性菌株响应差异较大，灵活调整实验周期。

2. 仪器参数设置

恒温静态培养，可开启低速间歇振荡缓解菌体沉降；时序图像采集间隔设置15~40 min。开启Z轴堆叠成像，捕捉悬浮完整菌体与微小裂解碎片；全程锁定曝光、增益、对焦参数，保证各组数据横向对比。全程密闭封板，减少水分蒸发与外界污染。

3. 观测重点阶段

细菌正常生长阶段；溶菌酶起效，完整菌体数量下降阶段；菌体大量裂解形成碎片；耐受菌体残存或恢复生长阶段。

三、UniExplorer软件数据分析策略

1. 算法选择

SESA算法：统计菌体总投影面积，生成整体动力学曲线；

SEAL算法：核心分析手段，单细胞轮廓分割，依据细胞尺寸、圆度筛选完整菌体，剔除裂解碎片信号。

2. 核心定量指标

动力学指标：裂解起始延迟时间、最大裂解速率、完整菌体最低面积、后期耐受菌回升时间；

形态指标：完整细胞占总颗粒比例、碎片丰度、菌体形态畸变比例；

评价标准：完整菌体占比持续下降作为溶菌酶有效裂解判定依据。

3. 数据降噪处理

利用空白孔扣除培养基杂质、气泡背景；区分培养基沉淀颗粒与细菌碎片；严格依靠形态参数过滤碎片，避免碎片信号高估生物量。

四、常见实验干扰与优化对策

1. 裂解碎片干扰定量：依靠SEAL设置细胞尺寸阈值，过滤微小碎片，仅统计完整菌体；

2. 菌体沉降导致视野数据波动：启用间歇振荡，图像采集前短暂静置；

3. 长时间培养渗透压变化：选用适配封板膜，降低水分蒸发；

4. 细菌自溶干扰结果：设置不加溶菌酶的细菌对照组，扣除自溶带来的菌体衰减。

五、论文材料方法标准英文描述

The bacteriolysis kinetics induced by lysozyme were measured using the oCelloScope time-lapse imaging system. Bacterial suspension was inoculated into 96-well microplates with gradient concentrations of lysozyme. Bacteria-only positive control and medium blank control were established simultaneously. Microplates were incubated at constant temperature, and Z-stack tilted images were captured at regular intervals. The SESA algorithm was used to obtain the dynamics of total particle area. The SEAL algorithm was applied to distinguish intact bacterial cells from lysis debris by morphological parameters, so as to accurately judge cell lysis. At least three biological replicates were set for each treatment.

中文释义：

采用oCelloScope时序成像系统测定溶菌酶诱导的细菌裂解动力学。菌悬液接种至含有梯度浓度溶菌酶的96孔微孔板，同步设置纯细菌阳性对照组与培养基空白对照组。微孔板恒温培养，按照固定间隔采集Z轴倾斜堆叠图像。SESA算法获取颗粒总面积动态变化；SEAL算法借助形态参数区分完整细菌与裂解碎片，实现菌体裂解精准判定。每组处理至少设置三组生物学重复。

六、适用研究场景

溶菌酶最低有效浓度筛选、pH/温度对溶菌酶活性影响测试、细菌耐受溶菌酶机制研究、溶菌酶与抗生素协同抑菌评价、不同菌株对溶菌酶敏感性高通量检测。