一 实验目的
1 依托丹麦BioSense oCelloScope微生物生长动态监测系统，建立微孔内霉菌成像投影面积与平板涂布CFU活菌计数的一一对应取样体系，完成两项指标线性相关性验证，确立成像像素面积替代传统平板计数的定量依据。
2 量化不同培养时长、不同初始接种量、药剂胁迫条件下霉菌图像面积与活菌数量的拟合方程、决定系数R²，明确适用线性区间，为后续仅依靠仪器成像数据直接表征霉菌活菌载量提供标准化方法。
3 解决传统CFU操作繁琐、耗时久、破坏性取样无法连续追踪同一孔位样本的缺陷，建立非侵入式动态成像定量替代活菌计数的验证规范，用于抑菌效力、生长动力学数据结果互认。
4 形成取样时点匹配、平行对照统一、数据校正规则固定的可复现验证操作流程，保证相关性结果可靠可重复。
二 实验前期材料、仪器与前期准备
1 试验菌株与梯度孢子悬液配制
选用黑曲霉、青霉、镰刀菌等丝状霉菌作为验证菌株，PDA固体培养基26℃培养7d收获成熟分生孢子。
使用含0.05%吐温80无菌生理盐水洗脱孢子，四层无菌纱布过滤去除菌丝团，血球计数板计数后进行梯度稀释，设置6个连续接种浓度梯度：1×10²、5×10²、1×10³、5×10³、1×10⁴、5×10⁴ CFU/mL，覆盖低孢子萌发到菌丝大量生长区间。孢子悬液冰浴保存，30min内完成加板，避免提前萌发造成初始状态不一致。
2 培养体系与CFU计数配套耗材准备
液体培养采用PDB马铃薯葡萄糖液体培养基，121℃高压灭菌20min冷却使用，纯液体体系适配oCelloScope FluidScope Z轴堆栈扫描模式，不添加琼脂防止菌丝包裹无法破碎回收活菌。
平板计数使用固体PDA平板，配套无菌96孔深孔板、无菌枪头、无菌生理盐水、涡旋振荡器、梯度稀释管，用于后期微孔内霉菌菌丝打散梯度涂布。如需增设药物胁迫组别验证，提前配置防霉剂母液0.22μm滤器除菌，设置单一浓度处理组，考察胁迫下面积-CFU相关性是否依然成立。
试验分组：6个孢子接种浓度梯度组、溶剂对照组、空白培养基对照组、药物干预验证组。单孔终体积统一100μL。
3 oCelloScope仪器参数与成像定量规则预设
设备放置于恒温培养箱提前2h预热，完成光路灰度校准与空白培养基基线扣除，消除培养基杂质、微量代谢沉淀背景干扰。
UniExplorer软件新建相关性验证任务，扫描模式选择FluidScope液体Z轴多层扫描，开启SESA静态杂质过滤算法，剔除非菌丝颗粒像素，仅统计真实霉菌菌丝投影面积。
Z轴扫描步长10μm，全覆盖孔底沉降菌丝层；单块96孔板单次扫描≤3min；时序扫描节点设定为12h、24h、36h、48h、72h五个时间点，每个时间点先仪器成像读取菌丝面积，再对应取出平行孔做CFU计数，实现时点一一对应。
软件开启菌丝面积自动积分计算功能，直接导出每孔像素换算后的实际投影面积数值。培养箱温度恒定26℃，波动≤±0.5℃。
4 微孔板排布与破坏性取样平行设置
采用透明平底96孔低吸附微孔板，每一个接种浓度、每一个时间点预留至少6个平行复孔，其中3孔用于仪器非破坏性成像测面积，另外3孔作为破坏性取样孔用于后续菌丝打散、梯度稀释涂布测CFU，保证同一条件下两组数据配对。
微孔板最外圈孔填充PDB培养基作为蒸发补偿孔，防止长时间培养边缘孔液体挥发导致菌体浓度浓缩。24h以上培养使用透气疏水封板膜密封板体，保证通气并减少水分流失。整块板标记清晰，区分成像留存孔与取样牺牲孔，避免操作混淆。
三 实验完整操作流程
1 超净台无菌加样与微孔板预处理
全程二级超净台内操作，加样顺序固定：PDB液体培养基→溶剂/药物工作液→梯度霉菌孢子悬液，轻柔加样避免产生大量气泡。
全部孔位加样完毕后，微孔板300g低速离心1min，使孢子均匀沉降至孔底同一焦平面，同时排出孔内微小气泡，防止气泡遮挡成像导致面积计算偏低。
需要长时间培养的板体用透气疏水封板膜完整压实密封，室温避光静置60min，待液面稳定、孢子沉降完成后准备上机。
2 板体装载与时序成像任务启动
将密封微孔板卡入设备专用板架并扣紧卡扣，防止多次扫描板体位移造成成像偏差。
打开UniExplorer软件，选定96孔板型号，录入菌株、接种浓度梯度、培养温度、5个取样时间点，勾选逐孔菌丝面积自动导出、图像存储功能，核对参数后启动全自动时序扫描。
在每个预设时间节点，设备先对对应留存孔完成自动扫描并记录菌丝成像面积数据，仅取出预先标记的牺牲取样孔进行活菌计数，成像孔继续留在设备内培养直至下一个时间点，全程不扰动留存孔生长状态。
3 分时间点CFU活菌数检测操作
到达每个取样时间点后，在超净台内取出对应牺牲微孔板，每孔加入等量无菌生理盐水，使用多通道移液器反复强力吹打15次，配合涡旋震荡30s，将菌丝球充分打散为单细胞与孢子悬液，尽量降低菌丝抱团导致的计数偏低误差。
对打散后的菌液进行10倍梯度系列稀释，选取2～3个适宜稀释度，每个稀释度取100μL涂布于PDA固体平板，每个稀释度设置2个平板重复。涂布平板倒置26℃恒温培养48～72h，待菌落长出后人工计数，换算出原微孔内每孔总CFU活菌数量。
不同时间点、不同浓度梯度均按照同一打散、稀释、涂布规则操作，保证CFU计数系统误差一致。
4 数据汇总、相关性拟合与实验收尾
全部5个时间点成像面积数据与配对CFU数值全部采集完成后，终止仪器扫描任务，剩余微孔板121℃高压灭菌无害化处理。
将同一条件下平均成像面积作为自变量，对应平均CFU活菌数作为因变量，使用统计软件进行线性回归拟合，得到回归方程、相关系数r、决定系数R²，判断二者线性相关程度。同时分别拟合正常生长组与药物胁迫组两条曲线，对比胁迫环境下相关性是否发生偏移。
归档内容包括：各时间点原始成像图片、每孔面积导出表格、平板CFU计数记录表、线性拟合图表、回归参数结果，全部文件本地备份用于方法学验证报告撰写。
四 相关性判定指标与数据质控标准
1 核心验证评价参数
皮尔逊相关系数r，取值越接近±1代表线性相关性越强，微生物定量一般要求r≥0.9判定为高度相关；
线性决定系数R²，R²≥0.85说明霉菌成像面积可有效解释CFU活菌数变化，可替代计数用于定量；
线性回归方程斜率与截距，用于建立面积数值直接换算活菌量的计算公式；
不同生长阶段相关性稳定性，分别考察萌发早期、对数生长期、平台期的拟合效果，确定仪器定量适用生长区间。
2 组别表型对应关系判定
低接种量早期：孢子刚萌发，成像面积极小，CFU数值低，线性拟合起始段平稳；
中高浓度对数生长期：菌丝快速铺展，成像面积随活菌数同步上升，线性相关性最佳；
生长平台期：菌丝相互融合铺满微孔，成像面积达到最大值不再增长，但活菌数量仍小幅波动，此区间偏离线性，需在后续检测中注明适用范围。
3 数据有效性质控规则
空白孔无成像面积、无平板菌落；阳性梯度组成像面积随接种浓度升高单调上升；同一平行孔成像面积相对偏差＜5%，同一稀释度平板菌落计数偏差＜10%，判定本次相关性验证数据有效。
五 实验质控关键注意事项
1 菌丝打散充分性直接影响CFU准确性
霉菌菌丝球缠绕紧密，吹打涡旋不充分会造成大量菌丝团无法长成单菌落，CFU数值偏低，人为拉低与成像面积的相关性，必要时可采用无菌玻璃珠辅助震荡打散。
2 非菌丝信号严格过滤
培养基长期静置析出结晶、药物沉淀极易被软件计入面积，必须全程开启SESA杂质过滤，用空白孔基线扣除背景，保证面积仅代表真实霉菌生物量。
3 取样时点严格一一配对
必须同一培养时长下，留存孔测面积、牺牲孔测CFU，不可跨时间点交叉配对，否则生长进度不一致会直接导致相关性拟合失真。
4 高浓度菌丝融合区间明确界定
微孔空间有限，后期菌丝铺满孔底后成像面积进入平台期，不再与活菌数线性相关，在方法验证中需标注该区间不可用于定量换算。