一、原理概述

常规单焦平面成像仅捕捉微孔底部微生物信息，无法反映培养液内菌体垂直分布。oCelloScope依靠FluidScope倾斜照明搭配Z轴堆栈扫描，采集不同深度层面图像，结合UniExplorer软件完成空间分布观测、定量统计，适合悬浮孢子、菌丝球、沉降菌丝、混合菌群分层研究。

二、标准操作流程

1. 实验前期耗材与体系准备

选用硬质透明平底微孔板，根据实验需求配置菌液，培养液体积控制在合适区间，液面保持平整，避免大量气泡干扰光路。霉菌实验尽量选用低吸附微孔板，减少菌体贴壁聚集。按需使用透气封板膜密封微孔板，减少长期培养过程水分蒸发。

2. 仪器扫描参数设置

新建时序扫描项目，选择FluidScope倾斜照明模式。开启Z-stack堆栈扫描功能，设置扫描上下边界，扫描起点高于培养液液面，终点到达微孔底部。合理设置层间距，常规观测选用10μm~30μm步长；精细空间分布研究缩小步长至5μm~15μm。

设置扫描时间间隔，启动时序自动扫描，仪器按照设定逐层采集不同深度原始图像。

3. 图像数据采集与存储

完整保存每一层Z轴原始图像，软件同步记录每层对应的深度坐标。所有分层图像可批量导出，用于后续三维重构、分层菌体数量统计。

4. 软件分层分析方法

方式1：逐层单独查看。在UniExplorer内拖动深度轴，逐帧观察孢子、菌丝在培养液上层、中层、底部的分布差异，直观判断菌体沉降速度。

方式2：最大投影合成。启用最大强度投影算法，将所有深度图层融合为一张合成图像，快速汇总微孔内全部微生物结构，用于生物量总体计算。

方式3：分层定量统计。按照深度区间分组，分别统计不同层级的菌体面积、孢子数量、菌丝总长，量化垂直空间分布差异。

5. 辅助三维可视化手段

将整套Z-stack堆栈图片导出，导入第三方图像软件进行三维重构，直观呈现微孔内部菌体立体分布形态。

三、不同微生物观测实操要点

1. 丝状真菌（霉菌孢子、菌丝球）

孢子萌发初期大量悬浮于培养液中层，后期菌丝逐渐沉降贴底。通过Z轴扫描跟踪孢子沉降、芽管延伸、菌丝球形成过程，区分悬浮菌丝与底部贴壁菌丝，消除仅拍摄孔底带来的数据低估问题。

2. 酵母菌、细菌

单细胞微生物沉降速度较快，短周期实验可对比不同深度细胞数量，研究菌体沉降行为；药物胁迫下细胞聚团分层现象也可通过分层成像观察。

3. 混合菌群体系

利用分层成像区分不同菌群沉降特性，研究菌群竞争、共培养条件下的空间生态分布。

四、常见问题与优化注意事项

1. 气泡干扰：移液之后静置一段时间，消除微孔内微小气泡，气泡会遮挡光路，造成局部数据缺失。

2. 扫描范围设置：不要将扫描区间局限于微孔底部，必须覆盖整个培养液垂直空间，否则会遗漏悬浮菌体。

3. 层间距选择：步长过大容易漏掉细小菌丝与孢子；步长过小会增加图片数量，占用大量存储空间，延长扫描耗时。

4. 避免微孔震动：扫描过程不要移动微孔板，防止菌体空间分布被扰动，保证观测结果还原真实静态培养状态。

五、方法优势对比

传统单焦平面成像只能观测孔底菌体，容易低估悬浮微生物总量；浊度检测无法区分菌体分布位置。Z轴堆栈成像能够获取垂直方向完整空间信息，实现定性观察与分层定量相结合，也是oCelloScope相比普通显微镜、酶标仪开展微生物空间分布研究的核心优势。