一、实验目的

建立适配oCelloScope监测黄曲霉孢子萌发前6 h早期阶段的成像检测方案，捕捉孢子吸水膨胀、芽管伸出、初始菌丝发育全过程，定量萌发迟滞时长、孢子形态参数、早期活菌生物量，对比不同处理条件对于黄曲霉早期萌发行为的抑制效果，规避OD浊度无法识别微量早期芽管的缺陷。

二、实验前期准备

1. 菌株与孢子悬液制备

活化黄曲霉菌株，使用PDA培养基恒温培养直至产生足量分生孢子，加入无菌生理盐水轻柔洗脱孢子，经过多层无菌纱布过滤除去菌丝残渣，采用血球计数板调配至固定孢子接种浓度，实验前做好孢子活性检查。

2. 耗材和试剂准备

选用透明平底无吸附微孔板，平底结构保障Z‑stack光路能够拍摄孔底沉降的孢子；准备PDB液体培养基、待测抑菌物质、对应溶剂、无菌PBS缓冲液。外圈微孔装填无菌培养基作为蒸发缓冲孔，降低边缘孔水分蒸发带来的渗透压干扰。

3. 实验组设置

设置空白培养基对照组、无药物黄曲霉孢子阳性对照组、梯度浓度受试物处理组、溶剂对照组，每组设置3组生物学重复。所有组别孢子接种浓度保持一致，培养基体积统一。

三、仪器成像参数设置

1. 照明模式

全程开启FluidScope倾斜照明模式，倾斜光源可以分辨沉降在微孔底部的微小孢子以及刚萌发的纤细芽管，减少培养基反光造成的成像盲区。

2. Z轴堆栈扫描参数

设置扫描区间从培养液表层一直延伸到微孔底板，黄曲霉孢子沉降于孔底，将扫描重点集中在底板上方0‑80 μm范围；层间距设置5‑10 μm，精细捕获早期芽管，过大的层间距容易遗漏纤细初始芽管。

3. 时序扫描间隔

总监测时长设定6 h，0至2 h每10 min执行一次扫描，该阶段主要发生孢子吸水膨胀；2‑6 h每15 min扫描一次，用于监测芽管伸出、初生菌丝延展，完整留存全部时序分层图像以及BCA活菌生物量数据。

仪器培养温度设置黄曲霉适宜生长温度，监测阶段微孔板使用透气封板膜密封。

四、完整成像检测操作流程

1. 微孔板加样

依次向各个微孔加入PDB培养基、孢子悬液以及梯度浓度待测样品，缓慢吹打混匀，操作过程不要产生大量气泡，气泡会遮挡底部孢子成像。加样结束之后快速将微孔板放置于仪器载台，固定卡槽，马上启动扫描程序。

2. 0‑2 h孢子膨胀阶段观测

调取每一次Z轴成像图片，统计孢子圆度、孢子投影面积、孢子膨胀比例，记录孢子吸水活化的时间，对比各组孢子活化是否受到抑制，该阶段不会产生可见芽管，BCA数值仅有微小上涨。

3. 2‑6 h芽管萌发早期观测

逐层查看底板位置的成像画面，记录各个微孔内孢子首次长出芽管的时间、芽管长度、萌发孢子占全部孢子的比例。借助SESA算法识别芽管结构，剔除培养基杂质、灰尘颗粒干扰，导出各个时间点早期萌发阶段BCA活菌生物量。

4. 原始数据储存

保存全部Z‑stack分层图像、时序视频、每一层独立的BCA数据，后续单独提取孔底区域的数据进行分析，舍弃上层培养液无效成像信息。

五、后期数据处理方式

1. 统计各组孢子萌发迟滞期，也就是从实验开始直至第一批孢子长出芽管的时间。

2. 计算6 h终点时刻萌发率，统计长出芽管的孢子数量占总孢子数量的占比。

3. 采用梯形积分计算0‑6 h早期萌发阶段AUC，再算出AUC抑制率，评估受试物对黄曲霉早期萌发的抑制强度。

4. 对比芽管平均长度、芽管畸形等形态学指标，判断受试物是否造成初生芽管膨大、断裂、发育畸形。

六、实操关键注意事项

1. 孢子悬液需要充分混匀之后再添加进微孔，保证每个微孔内部孢子分布均匀，防止孢子扎堆堆积，堆叠之后难以分辨单个孢子萌发状态。

2. 扫描焦距重点落在微孔底板，黄曲霉孢子沉降至底部，上层培养液几乎不存在游离孢子。

3. 全程规避气泡，加样、封板的时候出现气泡会遮挡底部孢子，干扰成像识别。

4. 溶剂对照组用来排除有机溶剂对于孢子早期萌发的干扰，结果对比需要以溶剂组作为基准。