一、验证前期准备工作

1. 实验耗材与菌株准备

选用透明平底微孔板开展培养，选用目标霉菌菌株，配制适配霉菌生长的液体培养基，准备梯度浓度的受试抑菌试剂、无菌缓冲液。微孔板外圈孔添加培养基充当缓冲孔，规避长时间培育水分蒸发带来渗透压波动。

2. 设置实验组别

配置多组具备差异化菌丝生长量的样本，可以依靠接种不同孢子浓度、设置多梯度抑菌药物，制造由低到高的菌丝生长梯度。全部组别环境温度、培养基体积、培养时长保持统一，每组设置三次生物学重复。

3. oCelloScope仪器参数设定

开启FluidScope倾斜照明模式，开启Z‑stack堆栈扫描，扫描范围覆盖微孔底板以及上层培养液，层间距设置5‑10 μm。定时采集成像图像，借助SESA算法计算各组菌丝成像面积，导出BCA活菌生物量数值。

二、分步验证操作流程

1. 霉菌培养与时序成像检测

往微孔当中加入孢子悬液以及培养基，不同组别控制孢子接种量或者抑菌剂浓度。放置设备载台固定，按照固定的时间间隔执行Z轴扫描。每一次成像结束之后，软件输出该样本菌丝投影总面积、分层菌丝面积、BCA活菌生物量。

2. 标准参照数值获取

完成成像采集之后，可以采用干燥称重法测定霉菌菌丝干重，或是使用荧光定量方式测定菌丝总蛋白含量，当作真实物理生物量参照数据。每一个微孔成像结束之后立刻收集孔内全部菌丝，减少菌丝生长出现偏差。

3. 多梯度样本数据收集

依次整理全部重复样本的菌丝成像面积、BCA‑生物量、菌丝干重三组数据，剔除存在气泡、杂质污染、菌丝大量堆积堆叠的异常样本。

三、相关性分析步骤

1. 原始数据预处理

将成像得到的菌丝投影面积与对应的BCA活菌生物量进行配对，建立二维数据集；分层数据需要分开处理，上层浮游菌丝、底部贴壁生物膜菌丝独立做相关性检验。

2. 相关性计算

先绘制散点图，横轴为菌丝成像面积，纵轴为活菌生物量，观察散点分布趋势。之后开展皮尔逊相关系数计算，得到r值以及对应的P‑value。r越趋近于1，二者线性关联程度越高。

3. 线性回归拟合

搭建一元线性回归方程，以菌丝成像面积作为自变量，活菌生物量作为因变量，获取回归斜率、截距、决定系数R²。R²代表菌丝面积可以解释多少生物量的变化。

4. 不同生长阶段对比验证

分别调取孢子萌发初期、芽管延伸阶段、成熟菌丝网络阶段的数据，分段验证相关性。初期稀疏芽管阶段像素重叠低，线性关系稳定；菌丝高密度交错堆叠之后像素互相遮盖，成像面积增长放缓，线性相关性会下降。

四、干扰因素和判定标准

1. 孢子堆积堆叠，多层菌丝上下重叠，成像只能够采集表层像素，菌丝实际总量高于投影面积，破坏线性关系。

2. 死菌丝碎片、培养基沉淀物会被灰度识别成菌丝面积，BCA活菌生物量算法能够筛除死亡残骸，二者数值出现偏差。

3. 合格的线性相关结果一般要求R²大于0.9，代表菌丝成像面积可以可靠反映活菌生物量；萌发后期菌丝密集缠绕时适合优先选用BCA生物量参数。