一、基础理化配制条件

1. 琼脂添加浓度

针对oCelloScope微孔板成像监测丝状真菌，半固体低‑琼脂培养基琼脂质量浓度控制在0.2%‑0.5%区间，常规固体真菌培养基琼脂含量一般1.5%~2.0%。0.2%琼脂流动性偏弱、菌丝可以自由游动聚集形成菌丝球；0.4%‑0.5%质地偏稳固，能够固定菌丝生长空间，抑制菌丝大范围漂浮，可依据观测目的调整琼脂占比。

需要观测菌丝成团、游动特性选用0.2%~0.3%；需要限制菌丝大幅度漂浮、方便Z‑stack分层成像，选择0.4%‑0.5%。

2. 基础营养基质配置

曲霉、青霉选用PDA、察氏‑多克斯基质；病原曲霉使用RPMI‑1640；食品霉菌采用沙堡德培养基，所有营养组分按照常规真菌培养基配比调配。

3. pH环境

丝状真菌适宜酸性环境，整体pH调控至4.5‑5.5；致病型曲霉可调节至5.5‑6.0，配制结束之后完成pH校准。

4. 灭菌与分装条件

培养基全部成分溶解之后，121摄氏度高压灭菌15 min；灭菌之后水浴降温至45‑50℃，在无菌操作台分装进入96孔透明平底微孔板，每孔培养基体积保持一致，静置冷却直至形成柔软半固体凝胶，冷却阶段规避震动摇晃，防止琼脂凝胶结构遭到破坏。

二、适配oCelloScope成像的硬件使用条件

1. 微孔耗材要求

只能使用平底透明无吸附96孔板，U型底、V型底板会干扰底层Z轴对焦；微孔外圈孔装入同款半固体培养基充当蒸发缓冲孔，减缓长时间孵育水分流失、琼脂浓度升高变硬。

2. 成像光学参数条件

开启FluidScope倾斜照明模式，低琼脂基质透光性强，垂直光源容易产生强光散射，倾斜光源可以提高菌丝、菌丝球和半固体基质之间的画面对比度。

Z‑stack扫描区间覆盖微孔底板直至培养基表层，层间距设置5‑10 μm，半固体内部菌丝可以分布在培养基任意深度，分层扫描能够捕捉不同深度菌丝团聚体。

3. 仪器环境参数

仪器放置恒温培养箱内部，普通霉菌设置28‑30℃，烟曲霉等人体病原真菌设置37℃；环境湿度维持80%‑90%，防止半固体培养基表层脱水干结、琼脂硬化。

三、接种与孵育使用条件

1. 孢子接种浓度

半固体环境菌丝更容易互相缠绕成团，孢子接种浓度相比液体培养基下调，常规终浓度控制2×10³‑1×10⁴每孔，过高接种量会造成菌丝团堆叠厚重，遮挡下层菌丝，成像算法难以识别内部活菌结构。

接种结束之后低速短时间离心，促使孢子均匀沉降，不要剧烈震荡，震荡会提前造成菌丝团聚。

2. 透气条件

丝状真菌属于好氧微生物，微孔板盖上透气封板膜；低琼脂半固体氧气通透性优于硬质固体琼脂，长时间成像监测不需要担心表层缺氧。

3. 时序扫描周期条件

孢子萌发前期0‑8 h，每30 min扫描一次，观测孢子膨胀、芽管伸出；8‑24 h每60 min扫描一回，记录半固体基质内部菌丝延伸、菌丝球成型、团聚体解体动态。

四、不同科研方向对应的选用条件

1. 观测菌丝运动、菌丝成团行为，琼脂浓度选用0.2%‑0.3%，凝胶阻力低，菌丝可以自由迁移聚集。

2. 研究药物穿透三维菌丝球，选用0.4%‑0.5%琼脂，固定菌丝球位置，避免絮团四处漂移，保障多次Z轴扫描可以锁定同一个菌丝团聚体。

3. 开展孢子萌发动力学检测，优先0.3%琼脂，既可以阻止孢子漂浮，又不会束缚初生芽管延展。

五、限制性注意使用条件

1. 琼脂浓度不可超过0.6%，介质硬度上升之后会约束菌丝伸展，造成菌丝生长延迟，得到错误的动力学数据。

2. 培养基冷却凝固之后禁止剧烈晃动，震动会撕碎凝胶网络，造成局部琼脂质地不均匀。

3. 半固体培养基储存不适合冷冻，冻融之后凝胶结构崩坏，琼脂析出分层，不能够继续用于成像实验。

4. 厚层菌丝团出现堆叠遮挡的时候，依靠BCA活菌生物量参数定量，菌丝投影覆盖率仅适合松散菌丝阶段。