基于CHAID与oCelloScope实时监测的冷藏大黄鱼特定腐败菌生长模型构建与验证
摘要
为了预测冷冻水产品中微生物生长情况，建立特定腐败菌生长的模型十分重要。传统的生长动力学模型在处理具有缺省值的数据时准确度会下降，并且对微生物生长稳定期的预测有一定的偏差。该文以大黄鱼为例，选用卡方自动交叉检验(CHAID)方法建立特定腐败菌的生长模型，并与传统生长动力学模型进行比较。研究结果确认了弧菌是影响大黄鱼品质的特定腐败菌；基于CHAID方法所构建的预测模型准确性与数据量和数据变化率有关，并且在微生物指数生长期的预测准确性比传统生长动力学模型低，但在微生物生长的稳定期、数据变化较大的情况下比传统模型具有较高的准确性。因此基于CHAID的冷藏鱼类特定腐败菌的生长模型可以应用于预测产品中腐败微生物。
引言
国内外对鲜鱼产品的需求量持续增长。为了向消费者和用户提供大量高鲜度的鲜鱼产品，鱼从被捕获后的加工处理直到最后的销售，用冰保持鱼体冷藏链温度(0~10℃)是最经济、最有效的方法。作为最易腐败的一类食品原料，新鲜鱼类即使在冷藏链条件下，也会在较短时间内发生微生物增殖而引起品质下降。因此，监测和控制冷藏链中鱼的腐败微生物是水产品加工和流通业的重要任务。
有关鲜鱼中腐败微生物的研究表明，在冷藏条件下，鲜鱼中所含微生物只有部分参与腐败过程，这些适合生存和繁殖并产生腐败臭味和异味代谢产物的微生物就是该产品的特定腐败菌(specific spoilage organisms, SSO)。SSO是造成腐败的主要因素，其细菌数和产品的鲜度以及剩余货架期之间存在密切关系。因此，SSO微生物生长模型可以用来预测水产品鲜度和剩余货架期。
目前，国内外研究微生物生长状况主要是微生物生长动力学模型，包括微生物生长的一、二、三级模型，其中: 一级模型表征一定生长环境和条件下微生物数量与时间的关系; 二级模型描述环境因子的变化如何影响一级模型中的参数; 三级模型是计算机程序，是将一个或多个一级模型和二级模型整合成的计算机软件。比如: 许钟，杨宪时，肖琳琳研究了罗非鱼特定腐败菌生长动力学模型和对货架期进行了预测。澳大利亚Tasmania大学食品学院在假单胞菌生长模型的基础上开发食品腐败预测器(food spoilage predictor，FSP)。但传统的生长动力学模型在处理具有缺省值的数据时准确度会下降，同时对微生物生长稳定期的预测有一定的偏差。
数据挖掘技术作为新兴的技术，已经广泛应用于多个领域。其中，CHAID分析方法(chi-square automatic interaction detection，卡方自动交叉检验)是数据挖掘中分类树的一种方法，最初用于市场研究，是对市场进行细分的较新的方法。CHAID方法能够处理交互作用及缺失值较为复杂的数据，且方法易于掌握，结果解释较为简单。
本研究尝试将CHAID方法引入到微生物建模领域，并比较与传统微生物生长动力学模型的差异。以大黄鱼为例，通过试验确认其特定腐败菌并获取试验数据，运用CHAID方法对试验数据进行分类与处理，拟合特定腐败菌的生长过程，比较与传统微生物生长动力学模型的优缺点，并评价模型的稳定性。
1 材料与方法
1.1 样品选择与准备
大黄鱼在福建省捕获后，立即放入冰水中冷休克；选用大小基本一致的个体(每尾300~400g)作为试验样本，加冰保持温度在0~1℃，冷藏运达试验室。
郭全有等研究发现弧菌是大黄鱼腐败变质过程中的特定腐败菌。因此，选用弧菌作为基本研究对象。
1.2 培养基和试剂
为了获取其菌种，首先，确定弧菌基本培养基: 蛋白胨20g，NaCl 8.5g，水1000mL，调整pH值为8.9~9.1；其次，确定弧菌选择性培养基: 酵母膏粉5g，蛋白胨10g，枸橼酸钠10g，硫代硫酸钠10g，牛胆汁粉8g，蔗糖20g，氯化钠10g，枸橼酸铁1g，麝香草酚蓝0.04g，溴麝香草酚蓝0.04g，琼脂粉12g，蒸馏水1L，调整pH值为8.4。
1.3 纯种菌落分离
按无菌操作方法从鱼体表面取样，在细菌基本培养基上培养菌落，然后将挑取单个菌落分离于特定的选择培养基培养，将上述平板置37℃培养24~48h后挑取优势菌菌落进行纯培养。
1.4 菌种鉴定与确认
不同的微生物具有不同的酶系，其新陈代谢类型不同，对各种物质利用后所产生的代谢产物也不同。因此，可以通过特定的生理生化反应来鉴别在形态或其他方面不易区别的微生物。本试验根据《常见细菌鉴定手册》-伯杰氏分类系统进行鉴定。
对分离菌进行如下生理生化指标的鉴定: 肌醇、甘露醇、山梨醇、水杨素、鼠李糖、木糖、密二糖、乳糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、蔗糖、葡萄糖、蛋白胨水、硫化氢、淀粉酶、尿氨酸脱氢酶、赖氨酸脱氢酶、精氨酸脱氢酶及0、3%、6%、8%、10%的NaCl胨水。
1.5 0、5、10℃情况下菌种生长情况测定
将特定温度下培养的菌种以10倍稀释，取3个浓度合适的稀释度，利用丹麦Biosense公司oCelloScope微生物生长曲线分析系统进行实时、连续、无标记的微生物生长动态监测。该系统采用专利的液体6.25°光学扫描技术，能够自动测量微生物的生长动力学与形态学变化，灵敏度比传统光密度测量(OD值法)高250倍。将稀释后的菌液加入96孔板中，每个稀释度设置3个重复孔，置于oCelloScope系统中，在0℃、5℃、10℃恒温条件下进行连续监测。系统每15分钟自动扫描一次，持续监测144小时，通过图像分析和算法处理自动生成弧菌生长曲线数据，无需人工涂布计数。
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