乳过氧化物酶与黄嘌呤氧化酶的协同抗菌效应：婴儿口腔细菌的全基因组表达分析
4. 讨论
理解人体微生物组的发育至关重要，因为它在多种疾病中发挥作用，并能提供关于健康和早期风险因素的见解。本研究调查了从牛乳中分离的黄嘌呤氧化酶和乳过氧化物酶联合应用对15–17周龄母乳喂养婴儿口腔中培养的细菌的影响。
为了分离乳过氧化物酶，我们对现有方案进行了修改，使用酸化乳清代替凝乳酶生产的乳清，降低硫酸铵饱和度，并增加了阴离子交换色谱步骤。该方法获得了大量的乳过氧化物酶，但纯度低于原始方法，表现为A412/A280比值为0.5（对比0.8）。尽管如此，SDS-PAGE分析（图2）显示其他蛋白质污染极少，表明乳过氧化物酶纯度相对较高。较低的A412/A280比值可能表明乳过氧化物酶缺铁，这可能是因为使用了pH 3.5的酸化乳清——乳过氧化物酶中的血红素基团在412 nm处有吸收，而已知其在低pH下会降解。然而，乳过氧化物酶仍保留了足够的酶活性（表2），使其适用于抗菌测试。鉴于需要大量乳过氧化物酶，该分离方法被认为是可接受的。
细菌生长实验表明，无论单独使用乳过氧化物酶还是与黄嘌呤氧化酶联用，均对口腔细菌表现出剂量依赖性的抗菌作用（图3），这与先前针对单一细菌物种的研究结果相似。初步的生长曲线分析表明，培养基中已经存在足量的底物（黄嘌呤和硫氰酸盐），因为添加它们并未显著改变细菌生长。此外，在乳过氧化物酶处理中添加黄嘌呤氧化酶仅引起微小的生长变化，支持了过氧化氢已经过量的假设，使得黄嘌呤氧化酶在此设置中不那么关键。这些结果也可能提示乳过氧化物酶可能发挥超出其酶活性的抗菌作用，这值得进一步研究。
婴儿口腔细菌的组成分析显示，大多数细菌属于厚壁菌门，这与先前关于婴儿口腔微生物组的研究一致。然而，一个显著的差异是本研究中蜡样芽孢杆菌出乎意料的高丰度。其主导地位表明，即使经过短时间培养，蜡样芽孢杆菌也能胜过其他细菌，促使向单培养转变。已知蜡样芽孢杆菌能产生毒素并污染食物，也被鉴定为牙周病原菌，从一位青少年牙周炎患者的牙龈袋中分离出来，暗示其对口腔健康的潜在影响。先前关于蜡样芽孢杆菌的研究指出，单独使用乳过氧化物酶（2 μg/mL）不能抑制细菌生长，除非与硫氰酸盐和过氧化氢结合。相比之下，我们的研究发现，单独使用乳过氧化物酶就能以剂量依赖方式抑制蜡样芽孢杆菌的生长，尽管所需浓度更高。培养基成分的差异也可能解释这些不一致，因为Tenovuo的研究使用了含有盐类、酪蛋白氨基酸、酵母提取物和葡萄糖的生长培养基，而本研究使用的是脑心浸液培养基。
本研究还探讨了黄嘌呤氧化酶-乳过氧化物酶处理对细菌基因表达的影响。细菌对过氧化氢和/或次硫氰酸根的反应此前已在不同的实验设置中进行过研究，使得比较变得困难。一些研究使用预合成的次硫氰酸根以实现精确的浓度控制，而另一些则通过用乳过氧化物酶、硫氰酸根和过氧化氢（或产生过氧化氢的酶如黄嘌呤氧化酶）处理细胞来模拟体内逐渐暴露于次硫氰酸根的情况。此外，实验条件的差异，如生长培养基、细胞密度、细菌生长阶段和物质添加的时间，进一步影响细菌对活性氧的反应。细菌对次硫氰酸根的基因表达仅在少数生物体中研究过，包括大肠杆菌和铜绿假单胞菌。研究表明，次硫氰酸根处理会上调参与一般应激反应的基因，例如编码过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的基因。在这些研究中，铜绿假单胞菌细胞在预处理后用次硫氰酸根（0.8 mM）处理20分钟，而大肠杆菌细胞生长至指数期后用乳过氧化物酶（5 μg/mL）、过氧化氢（0.5 mM）和硫氰酸钾（0.5 mM）处理4小时。
本研究数据显示，多个与活性氧相关的基因受到黄嘌呤氧化酶-乳过氧化物酶处理的影响，其中大多数显示出意想不到的下调。一项关于大肠杆菌暴露于亚致死浓度过氧化氢的研究揭示，基因表达最初诱导了应激相关基因（过氧化氢酶、烷基过氧化氢还原酶、Dps蛋白和Fur），但在60分钟后，这些基因相对于对照组要么下调，要么不受影响。这表明细菌对过氧化氢的应激反应是瞬时的，这或许可以解释在本研究中经过4小时黄嘌呤氧化酶-乳过氧化物酶处理后观察到的下调现象。选择4小时的孵育时间是基于预实验的生长曲线，这使得细菌能够在指数期被收获，并有足够的材料用于DNA和RNA测序。然而，较短的孵育时间可能会提供不同的见解。
进一步研究次硫氰酸根对细菌和哺乳动物细胞翻译后修饰的影响提出了几种次硫氰酸根可能影响代谢的机制。一项研究表明，乳过氧化物酶、硫氰酸根和过氧化氢的联合作用抑制了乳链球菌中的关键糖酵解酶，包括葡萄糖-6-磷酸异构酶、醛缩酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶。另一项研究发现，用乳过氧化物酶、硫氰酸根和过氧化氢处理无乳链球菌细胞会导致葡萄糖摄取的强烈抑制。在小鼠巨噬细胞样细胞的研究中也报告了类似的发现，其中次硫氰酸根暴露通过靶向糖酵解酶（如果糖二磷酸醛缩酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和磷酸丙糖异构酶）导致糖酵解的剂量依赖性降低。总体而言，这些发现与本研究中观察到的关键糖酵解酶（丙酮酸激酶、醛缩酶和甘油醛-3-磷酸脱氢酶）下调一致。虽然先前的研究表明乳过氧化物酶产生的次硫氰酸根在翻译后水平抑制糖酵解酶，但我们的结果表明黄嘌呤氧化酶-乳过氧化物酶系统也在转录水平影响这些酶，据我们所知，这在以前尚未报道过。
5. 结论
本研究强调了婴儿口腔微生物组的动态性质及其对外部因素的易感性，为从牛乳中分离的黄嘌呤氧化酶和乳过氧化物酶对母乳喂养婴儿口腔中培养的细菌的影响提供了新的见解。单独应用乳过氧化物酶以及与黄嘌呤氧化酶联合应用，均对口腔细菌显示出显著的、剂量依赖性的抗菌作用，结果提示乳过氧化物酶可能发挥超出其酶活性的抗菌作用。基因表达分析显示，黄嘌呤氧化酶-乳过氧化物酶处理导致几个活性氧相关基因意外下调，表明这是一种瞬时的细菌应激反应。该研究还观察到关键糖酵解酶的下调，表明黄嘌呤氧化酶-乳过氧化物酶系统也在转录水平影响细菌代谢。这些发现突显了黄嘌呤氧化酶和乳过氧化物酶在调节口腔微生物组中的复杂作用，并为进一步研究它们在婴儿健康和疾病预防中的潜在应用奠定了基础。
资金
本研究得到奥尔堡大学、奥胡斯大学和阿拉博士奖学金项目的支持。此外，该项目还得到了奥胡斯大学创新食品研究中心（CiFOOD）的资助。
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