卡拉胶微生物检测中延时成像算法的应用
3. 结果与讨论
本研究评估了一种基于延时光学显微镜的快速方法，用于对卡拉胶为例的具有挑战性的吸湿性食品样品中的微菌落进行计数。这种方法有可能改善获得结果的时间，并导致食品制造商更快的产品放行。在以下章节中，我们介绍了当前传统平板计数在评估商业卡拉胶微生物质量时的挑战和局限性，以及延时光学显微镜方法如IntuGrow如何帮助规避这些问题。最后，我们介绍并讨论了两种方法的比较。
3.1. 传统微生物分析的挑战
使用均质器进行均质是制备食品样品以在琼脂平板上计数菌落的常见程序。在均质之前，食品样品通常以1:10的比例与无菌缓冲稀释剂混合。然而，发现卡拉胶样品与稀释剂之间更大的比例（>1:40）对于确保可以用琼脂倾注平板的样品粘度至关重要。此外，即使在行业中使用的100×稀释倍数下，卡拉胶在混合时仍观察到在稀释剂中结块，这会阻止均匀和准确的移液，包括转移到琼脂平板，这是由于移液器的限制。卡拉胶的100×稀释导致当前标准行业方案中的检测限为40 CFU/g。然而，该检测限受到该稀释倍数下卡拉胶结块的挑战，这使得琼脂平板上的菌落计数成问题。虽然更高的稀释倍数可能防止结块，但它将导致更高的检测限，这是行业所不希望的。据我们所知，尚未确定卡拉胶中的细菌细胞在多大程度上存在于团块中或释放到用于平板的液体中。
对于水胶体如卡拉胶，由于卡拉胶释放二氧化碳气体，气泡可能在琼脂中发展。琼脂中捕获的气泡破坏了固化凝胶的视觉均匀性，导致手动计数菌落更容易出错，并产生假阳性结果，因为气泡可能被误计为琼脂中的小菌落。除了产生各种大小的气泡外，卡拉胶还可以在琼脂中产生浑浊的背景。
图2. 均匀稀释100倍的卡拉胶样品在琼脂平板培养中的问题。A/B：卡拉胶会形成凝胶状结构和气泡，这些结构可能被误判并计为菌落。此类结构通常出现在培养皿底部附近，而真正的菌落则遍布整个琼脂表面。C/D：卡拉胶会导致培养基背景变得浑浊，并产生含有微小颗粒和气泡的干扰结构；在培养初期（24–48小时）和计数阶段（72小时），根据样本微生物群落的不同，这些结构可能被误认为是小型菌落。E/F：在5%浓度的琼脂平板中观察到芽孢杆菌属菌群的聚集性菌落，这使得此类平板的菌落数量统计变得不可能或极具挑战性。
除了溶解和未溶解的卡拉胶引起的问题外，细菌菌落的蔓延能力使得用传统平板计数制备的平板计数变得困难。在本研究中，通过MALDI-TOF MS鉴定芽孢杆菌属是导致两种方法制备的琼脂平板中5%观察到的蔓延的原因。芽孢杆菌属的蔓延运动被描述为对琼脂平板整个表面的快速定殖。一般来说，当琼脂平板表面被蔓延定殖时，由于缺乏可见性，无法计数底层菌落。特别是芽孢杆菌属的蔓延是商业微生物质量控制实验室技术人员面临的已知问题。除了图2所示的问题外，当单个可见菌落来自多个相邻微菌落的合并时，传统平板计数同样面临挑战，因此可能导致计数低估。
除了这些挑战外，获得结果的时间是一个重要参数。根据卡拉胶制造商使用的行业方案，传统平板计数需要72小时的培养，但根据我们当时的观察，通常无法区分具有菌落形态的气泡是否确实是菌落，以及计数被蔓延细菌覆盖的琼脂平板中的菌落。等待CFU/g结果的时间也延迟了制造商向客户或下游过程放行其产品。因此，减少完成微生物质量评估的时间将使制造商能够更早地放行产品。为了解决这些挑战，延时显微镜方法可能可以规避这些问题，并允许更早地检测和计数微菌落（20小时），如下文所示。
3.2. 延时显微镜的应用以规避传统平板计数的挑战
最初将传统卡拉胶样品制备和稀释方法以不同稀释倍数应用于迷你琼脂平板的琼脂表面，导致更高的检测限，并且由于卡拉胶和琼脂在迷你琼脂平板中结块，导致IntuGrow显微镜图像质量差。因此，传统方法的方法不能直接转移到迷你琼脂平板，需要建立新方法。在尝试了几种解决方案后，发现将卡拉胶粉末分散在两层琼脂之间可以限制卡拉胶的干扰吸湿性质。这使得基于延时光学显微镜的计数成为可能。使用本研究中自适应的IntuGrow DELAY算法，通过在卡拉胶样品膨胀稳定后开始图像校正，可以获得高质量的延时图像。图3展示了处理自适应算法前后的迷你琼脂平板图像。在原始图像中，由于卡拉胶形成的伪影（碎片或气泡）的存在，无法计数菌落，这些问题也在使用传统平板计数方法的琼脂平板中造成问题。然而，通过应用自适应算法，可以区分活跃生长的菌落与卡拉胶伪影。可以观看生长微菌落的延时视频。
图3. 使用IntuGrow延迟算法处理原始显微图像前后(A)和(B)微生物微菌落的图像计数结果。微生物微菌落（示例用黄色圆圈标出）在处理后的图像中呈现为黑色斑点；而基于时间序列处理的延迟算法则将未生长的卡拉胶碎屑和气泡去除，显示为白色圆点或灰色凹坑（此类示例用红色虚线圆圈标出）。（关于图例中颜色标注的解读，请参阅本文的网络版本。）
基于延时显微镜图像的监测使得在<20小时内进行可靠检测成为可能，而传统平板计数需要72小时。这很重要，因为它将使食品制造商能够显著更快地评估微生物质量，延时显微镜方法和传统平板计数方法分别在12-20小时和72小时后获得最终结果。通过延时图像，还可以在微菌落生长在一起之前对其进行计数。
因此，自适应算法能够解决与先前报道研究类似的问题。此外，其修改使其能够在具有挑战性的样品（如迷你琼脂平板中的卡拉胶粉末）上执行，而不仅仅是在特殊玻璃载玻片细菌培养装置上的细菌悬浮液或软TSA平板上的易均质食品（如长叶莴苣）上工作。
蔓延在使用传统平板计数方法及其终点计数评估几种卡拉胶样品中的微生物浓度时造成了问题。总的来说，在评估的181个琼脂平板中，蔓延发生了九次（5%），这阻碍了这些平板结果的使用。在传统平板计数分析的第一天培养期间发生蔓延，在所需的72小时培养期后，蔓延细菌完全覆盖了琼脂表面，使得菌落计数不可能。蔓延细菌平板以前未使用成像方法进行分析，因为其他研究使用细菌悬浮液或接种了无法蔓延的细菌的水样。当使用IntuGrow评估微生物质量时发生蔓延时，可以使用基于延时的功能在蔓延覆盖迷你琼脂平板表面之前早在13小时就对微菌落进行计数。可以观看整个迷你琼脂平板上生长微菌落被蔓延芽孢杆菌属覆盖的延时视频，其中还可以观察到在35°C下培养20小时后，迷你琼脂平板中的蔓延几乎完成。
一般来说，微生物微菌落随机分布在琼脂表面和内部。据我们所知，其他人大多展示了涂布平板上菌落的基于图像的检测，而本研究对源自分散在两层琼脂之间的样品材料的微菌落进行了成像。在倾注平板内，微菌落可能位于琼脂的不同深度，并且取决于微菌落的蔓延能力，相邻菌落可能被覆盖而不再能被实验室操作员计数。先前研究使用高光谱成像技术展示了在细菌菌落水平上分离相邻菌落，但不是在微菌落水平上，如本研究所做的。
图4。基于延时显微镜图像的微生物计数技术可在芽孢杆菌属（Bacillus spp.）开始群游覆盖其他菌落之前完成菌落计数。黄色圆圈标示的菌落因群游现象无法通过传统终点计数法进行计数。完整的延时记录视频详见补充文件S3。（关于图例中颜色标注的解读，请参阅本文网络版。）
通过评估低和高污染的卡拉胶样品，测试了IntuGrow DELAY算法，以确定它在图像处理过程中如何处理不同的微生物浓度。结果表明，自适应算法能够将高、中、低污染水平的卡拉胶样品的结果转换为可用于计数的图像。可以使用≤20小时培养期的延时图像在微菌落变得肉眼可见之前对其进行计数。研究的延时显微镜方法无需样品稀释即可检测到的最高细菌负载约为4.2 log CFU/g（14,750 CFU/g，对应于每个迷你琼脂平板295 CFU）。
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