葡萄牙棒孢酵母J5对乙醇、糖、pH及温度的耐受性评估
2 结果与分析
2.1 葡萄牙棒孢酵母J5菌落形态分析
由图1可知，J5菌落形态为直径1～2 mm的凸起状半圆球，呈奶油色，表面湿润光滑，边缘整齐，易挑取；细胞为椭圆形，具有典型的酵母细胞壁结构，胞浆中含有颗粒状细胞器。
图1 J5的菌落及细胞形态
2.2 葡萄牙棒孢酵母J5的生长特性分析
由图2可知，0～8 h葡萄牙棒孢酵母J5处于延滞期，8 h进入对数生长期，20 h进入稳定期，70 h进入衰亡期。对数生长期内细胞活力高、繁殖力强，因此选择该时期菌体培养物作为种子，有助于保障后续发酵效果。
图2 J5生长曲线
2.3 葡萄牙棒孢酵母J5的耐受性分析
在红谷黄酒的工业酿造中，酵母可能会面临因散热不畅而导致的高温环境、因原料中碳水化合物被酶快速分解而产生的高渗透压以及因代谢产物（如乙醇、有机酸）积累而产生的毒害作用。因此，有必要考察葡萄牙棒孢酵母J5在不同条件下的耐受能力。
非酿酒酵母的乙醇发酵力弱，对乙醇的耐受性低于酿酒酵母。由图3a可知，当发酵体系中乙醇体积分数低于6%时，发酵液OD值较稳定；当乙醇体积分数高于6%时，发酵液OD值明显降低，说明葡萄牙棒孢酵母J5对乙醇的耐受性较弱。黄酒中乙醇体积分数一般大于6%，因此需要将葡萄牙棒孢酵母J5与酿酒酵母同时接种或先于其接种。
图3 J5的耐受性测定
a～d.分别为乙醇耐受性、糖耐受性、酸耐受性、温度耐受性。
糖是发酵产生乙醇的主要基质，也是酵母赖以生存的能源物质，但高浓度糖对酵母的生长繁殖有抑制作用，高渗透压会导致酵母细胞失水。由图3b可知，当发酵液糖质量浓度高于15 g/100 mL时，葡萄牙棒孢酵母J5的生物量随糖质量浓度的增加而快速降低。说明高浓度糖不利于葡萄牙棒孢酵母J5的生长繁殖。在黄酒酿造过程中，糖质量浓度最高在12 g/100 mL以下。结果表明，葡萄牙棒孢酵母J5在黄酒酿造的最高糖质量浓度条件下可以生长。
发酵过程中随酸性代谢产物的积累，发酵液pH值逐渐降低，过低的pH值会抑制菌体生长。由图3c可知，当pH 5.0～6.0时葡萄牙棒孢酵母J5能够正常生长，在pH 3.5～4.5时葡萄牙棒孢酵母J5的生物量较pH 5.0～6.0时有所降低，pH值低于3.5时葡萄牙棒孢酵母J5的生长明显受到抑制，说明葡萄牙棒孢酵母J5对酸性环境具有一定耐受性。黄酒发酵过程中pH值在3.0～4.5之间，结果表明，葡萄牙棒孢酵母J5在该pH值范围内也能够生长。
由图3 d可知，在实验考察的温度范围内（20～50 ℃），葡萄牙棒孢酵母J5发酵液的生物量在25 ℃时达到最大值，随着温度的升高发酵液OD值逐渐降低；发酵温度高于40 ℃时，菌株的生长明显受限；温度达到50 ℃时葡萄牙棒孢酵母J5不生长。结果表明，葡萄牙棒孢酵母J5具有一定的耐热性，在20～40 ℃范围内其能够生长。黄酒主发酵阶段的温度区间为20～34 ℃，葡萄牙棒孢酵母J5的适宜生长温度范围处于这个温度波动区间内。
综上，葡萄牙棒孢酵母J5能够耐受黄酒发酵的环境，因此可用于黄酒酿造。
2.4 发酵产物分析
2.4.1 发酵过程中的乙醇、总酸变化分析
由图4a可知，发酵液中乙醇质量浓度随发酵时间的延长而显著增加，说明葡萄牙棒孢酵母J5能够发酵产乙醇，但其产乙醇能力（（5.34±0.15）g/L）远远低于酿酒酵母，因此葡萄牙棒孢酵母J5对较高浓度乙醇环境的耐受性弱。由图4b可知，发酵液中总酸质量浓度随发酵时间的延长而显著增加，说明葡萄牙棒孢酵母J5在发酵过程中会积累酸性代谢产物。
图4 J5发酵液中乙醇（a）和总酸（b）质量浓度
不同字母表示差异显著（P＜0.05）。
2.4.2 发酵过程中的有机酸变化分析
葡萄牙棒孢酵母J5在发酵过程中积累的酸性物质主要为有机酸。有机酸是酒类产品中重要的呈香呈味物质，适量有机酸可以改善酒类产品的口感和风味。由图5可知，柠檬酸、琥珀酸和乙酸的质量浓度随时间的延长而增加，在发酵液中积累。丙酮酸、乳酸质量浓度呈先增加后减少的变化趋势，可能是二者与其他发酵产物发生反应，或被J5重新利用。富马酸质量浓度在发酵过程中略有降低，但变化不明显。柠檬酸的酸味明亮、清爽，对甜味有调节作用；乙酸的酸味尖锐，口感厚重；琥珀酸的酸味弱，主要呈鲜味并提供饱满的口感，它们对黄酒的风味均有贡献作用。由于在发酵过程中葡萄牙棒孢酵母J5能够使柠檬酸、琥珀酸、乙酸积累，因此推测将葡萄牙棒孢酵母J5应用于黄酒发酵可以提升产品风味。
图5 不同时间下J5发酵液中各有机酸含量的变化
2.4.3 挥发性代谢产物分析
2.4.3.1 挥发性代谢产物分布
将HS-SPME-GC×GC-QTOF-MS检测到的挥发性代谢产物按官能团划分为醇类、酯类、酸类、醛酮类、吡嗪类、酚类、呋喃类、烃类和含硫类。
由图6a可知，J2和J5发酵液中醇类、酯类、酸类和醛酮类化合物的总相对含量均达到了94%以上，实验重现性较好。对两种酵母产生的各类挥发性物质相对含量进行差异分析（独立样本t检验），酯类、酸类、呋喃类、烃类、含硫类在两种酵母发酵液中的相对含量差异不显著，醇类、醛酮类、吡嗪类、酚类差异显著。由图6b可知，J5发酵液中醛酮类、吡嗪类、烃类、含硫类化合物数量多于J2发酵液，醇类、酯类的化合物数量少于J2发酵液。
图6 各类化合物分布
a.各类化合物相对含量；b.各类化合物数量。
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