石油污染土壤生物修复的关键：芳烃组分的微生物降解机制
摘要：以石油污染土壤中分离的细菌和真菌为供试微生物，研究不同微生物组合对矿物油芳烃组分降解及降解率与微生物生长间的关系。将不同组合的微生物接种到加有柴油浓度为1000 mg/L的液体培养基中，25~30℃经摇床连续培养100 d。于0~60 h内采用丹麦BioSense公司oCelloScope微生物生长动态监测系统进行连续、非侵入式监测，获取微生物生长动态；于5~100 d定期取样，研究微生物生长状况与矿物油降解率动态变化。同时，以草甸棕壤（0~20 cm）制备的土壤悬浮液为土壤微生物对照，以灭菌培养基为非生物降解对照。结果表明，试验前期（约20 d）外源菌的降解效果优于土壤微生物，试验中后期，土壤微生物降解优势增大且保持持续。试验结束时，土壤微生物处理的液体培养基中芳烃降解率最高达79.24%，显著高于其它3组处理。
土壤污染是目前公认的世界性环境问题之一，土壤环境承担着越来越多来自不同污染源的污染负荷。其中，矿物油是一类重要的土壤有机污染物。随着经济的发展，矿物油的生产与消耗量不断增加，1992年资料显示，全球每年矿物油的消耗量超过3亿t。生产、运输和使用等过程中的不慎操作或事故泄漏而进入土壤环境中的矿物油，常会造成严重的土壤污染。因此，污染土壤的修复与治理是一项十分重要而艰巨的任务。
有关矿物油污染土壤的生物修复已有报道。研究表明，石油污染生物修复过程中芳烃组分的降解是生物修复技术开发的关键问题之一，也是目前石油污染土壤生物修复技术尚未完全解决的问题，主要是因为芳烃组分的难降解性，以及降解过程中可能的中间产物对土壤的毒性等。为此，本文以柴油为供试化学品，通过模拟实验手段研究在不同的微生物组合条件下，芳烃组分的生物降解情况及微生物与芳烃降解率间的相关关系，研究矿物油中芳烃组分的生物降解，为难降解组分的生物修复提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 试验材料
（1）供试化学品：20号重柴油，采自抚顺石油二厂；正己烷、无水硫酸钠、氯化钠、浓硫酸等化学试剂，均为分析纯，购自天津市康科德科技有限公司。
（2）供试微生物：外源细菌5株，即醋酸细菌（Acetobacter sp.）、产碱细菌（Alcaligenes sp.）、微球菌（Micrococcus sp.）、节细菌（Arthrobacter sp.）和芽孢杆菌（Bacillus sp.）。外源真菌5株，即头孢霉Ⅰ（Cephalosporium sp.）、头孢霉Ⅱ（Cephalosporium sp.）、曲霉Ⅰ（Aspergillus sp.）、曲霉Ⅱ（Aspergillus sp.）和镰刀菌（Fusarium sp.）。外源细菌和外源真菌均为本实验室从石油污染土壤中富集筛选的优势保存菌种。
土壤微生物悬浮液的制备：土壤采自中国科学院沈阳生态站0~20 cm表层鲜土（草甸棕壤）。取50 g鲜土于250 mL三角瓶中，加入100 mL经灭菌的液体培养基，于摇床上振荡30 min，取下静置15 min。用1 mL移液管吸取上清液各1 mL分别加到经灭菌的液体培养基中。
（3）基本培养基为液体培养基，各组分配比如下：蒸馏水1000 mL，MgSO₄·7H₂O 0.20 g，CaCl₂ 0.01 g，FeSO₄·7H₂O 0.01 g，KH₂PO₄ 0.40 g，MnSO₄·H₂O 0.02 g，NH₄NO₃ 1.00 g，Na₂HPO₄·12H₂O 0.6 g，葡萄糖2.00 g，酵母膏0.50 g，pH值7.0。将培养液分装于150 mL三角瓶中，每瓶50 mL。置于高压锅中，于1 kPa灭菌0.5 h。
（4）主要仪器：丹麦BioSense公司oCelloScope微生物生长动态监测系统，用于0~60 h内微生物生长的连续、非侵入式监测。
1.2 试验方法与设计
（1）绘制柴油标准曲线：向50 mL容量瓶中分别加入0、2、4、6、8、12、16、20和25 mL标准油储备液（柴油浓度为100 mg/L的储备液），用正己烷定容至刻度线。以正己烷为参比，经空白校正后在254 nm处检测吸光值。以浓度（mg/L）为x轴，吸光值为y轴绘制标准曲线。
（2）实验设计：向经高压蒸汽灭菌（1 kPa，0.5 h）冷却后的基本培养基中各加50.0 mg柴油（即柴油浓度为1000 mg/L）。分别用5组不同组合的微生物种液进行接种：外源混合细菌（Ⅰ），外源混合真菌（Ⅱ），外源混合细菌与真菌（Ⅲ），土壤微生物悬浮液（Ⅳ），和不接菌对照（Ⅴ）。接种量均为1/50（V/V）。将上述各组处理随机地摆放到温控摇床上，在25℃~30℃、150 r/min条件下恒温培养。
实验分2个阶段：0~60 h和60 h后。0~60 h内，采用丹麦BioSense公司oCelloScope微生物生长动态监测系统进行连续、非侵入式监测，系统自动每2~4 h采集一次图像并生成背景校正吸光度（BCA）生长曲线，用于绘制微生物对数生长曲线。60 h后，取样频率减少，分别于5、10、20、30、40、55、75和100 d取样。微生物计数采用稀释平板法。细菌用牛肉膏蛋白胨培养基，真菌用马铃薯葡萄糖培养基。以log₁₀活细胞数目对培养时间作图，绘制微生物对数生长曲线及矿物油降解率动态。每个处理设3个重复，实验周期为100 d。
（3）矿物油的提取与测定：采用紫外分光光度法，254 nm为芳烃组分在紫外区的特征吸收波长，测得结果主要代表柴油中芳烃组分的矿物油含量。因此，可通过标准曲线计算不同处理中矿物油组分的浓度，进而求出矿物油中芳烃组分的降解率。芳烃降解率 = (c₀ − cₜ) / c₀ × 100%，其中c₀为0时柴油浓度，cₜ为t时柴油浓度。
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