丹麦奶酪盐水分离的汉森德巴利酵母菌株遗传多样性与抗真菌活性关联分析
讨论
在本研究中，我们评估了从丹麦奶酪盐水分离的D. hansenii菌株对乳制品污染霉菌的抗真菌活性。我们的PFGE结果证实了D. hansenii的遗传异质性。在先前的研究中，D. hansenii菌株间的染色体多态性可与不同的pH和NaCl耐受性相关联。本研究中发现的D. hansenii菌株间酸化或脱酸化能力的变异，在一定程度上可与观察到的遗传变异相关联。肉汤培养基（添加了4%（w/v）NaCl的MYGP）的pH差异可能与D. hansenii产生或同化有机酸、蛋白水解活性、氨的产生、细胞裂解以及若干其他因素有关。相反，本研究中D. hansenii菌株产生的VOCs图谱无法与PFGE观察到的特定染色体聚类相关联，尽管观察到菌株间VOC产生的差异。
菌株依赖的VOC图谱此前已在来自传统绵羊和山羊奶酪的D. hansenii菌株中观察到，这些菌株在M13小卫星上存在差异。在五种污染霉菌中，娄地青霉除了是表面成熟奶酪上的污染物外，还是蓝纹奶酪生产中众所周知的起子培养物。毛霉属在多种霉菌成熟奶酪上众所周知，尤其是来自生奶硬质奶酪如Saint Nectaire和Tomme de Savoie，而总状毛霉尤其从法国奶酪中分离。此外，燕麦镰刀菌主要被报道为谷物上的霉菌毒素产生病原体，在凉爽潮湿或湿润条件下尤为明显，但它也被分离为意大利奶酪上的污染霉菌。同样，燕麦镰刀菌在本研究中被分离于丹麦乳制品厂并鉴定到物种水平。最后，枝孢霉属已从传统意大利奶酪中分离。最初在丹麦乳制品厂分离的反色枝孢霉和弯曲枝孢霉被鉴定到物种水平，以用于本研究。然而，反色枝孢霉和弯曲枝孢霉迄今为止主要从植物材料中报道。总而言之，这表明乳制品环境中污染霉菌的物种多样性巨大，远超通常研究的范围。
在本研究中，D. hansenii无细胞上清液抑制了孢子（分生孢子）萌发，对霉菌生长仅有轻微抑制效果，表明为抑真菌效果，这可能与五种霉菌的孢子或分生孢子的形态有关。有趣的是，两种枝孢霉属物种，即反色枝孢霉和弯曲枝孢霉，对D. hansenii无细胞上清液的反应非常不同。反色枝孢霉的萌发和菌丝体生长被D. hansenii菌株的无细胞上清液显著抑制，而我们对弯曲枝孢霉仅观察到轻微的萌发抑制，对菌丝体生长无影响。枝孢霉属是暗色丝孢菌中最大的属之一，包含多个复合群，主要基于分生孢子形态进行形态学区分。反色枝孢霉属于枝孢霉复合群，包含多达八个分生孢子的长链，壁通常不增厚。弯曲枝孢霉属于草本枝孢霉复合群，包含单个分生孢子或多达四个分生孢子的短链，由于表面装饰而显得壁厚。这些差异可能解释了两种枝孢霉物种之间观察到的敏感性差异。
在D. hansenii产生的71种VOCs中，五种目标VOCs（乙酸、3-甲基丁酸、丙酮、2-苯乙醇和2-戊酮）与反色枝孢霉和娄地青霉的萌发和/或菌丝体生长抑制具有强关联，被选用于详细分析。相应地，D. hansenii已被证明在奶酪样培养基中产生乙酸、丙酮、3-甲基丁酸、2-戊酮和2-苯乙醇。此外，D. hansenii增加了羊奶酪中2-戊酮的含量。在我们的研究中，3-甲基丁酸具有最强的抑制效果，对反色枝孢霉和娄地青霉的萌发和菌丝体生长的IC50最低，分别为10⁻⁵和10⁻⁴ mol/L。3-甲基丁酸的感官阈值据报道为120-700 ppb（1.17-6.85×10⁻⁶ mol/L），在较高浓度下，这种支链脂肪酸被描述为在法国表面成熟奶酪中贡献令人不快的气味，如地板布、脚和汗味。本研究中检测到的3-甲基丁酸估计浓度（10⁻⁶ mol/L）因此处于感官阈值范围内，但低于上述IC50值。即便如此，使用产生3-甲基丁酸的D. hansenii菌株作为生物防治剂仍然具有吸引力。在不同加工条件下可能获得更高水平的3-甲基丁酸，如报道中NaCl和乳酸盐增加了D. hansenii产生的3-甲基丁酸水平，仍需在相关成熟条件下的奶酪中进行详细分析。
挥发性化合物2-苯乙醇被报道为多种生物防治酵母产生的常见抑制化合物，包括尼泊尔德巴利酵母、异常威克汉姆酵母、美极梅奇酵母、酿酒酵母和满洲毕赤酵母。在本研究中，我们发现2-苯乙醇对反色枝孢霉和娄地青霉的萌发和菌丝体生长具有强抑制效果，浓度为10⁻³ mol/L。相应地，我们此前发现2-苯乙醇在15×10⁻³ mol/L时完全损害了另外两种食品腐败霉菌——扩展青霉和北方青霉的分生孢子萌发、菌丝膜完整性和生长。本研究中D. hansenii菌株产生的2-苯乙醇浓度约为10⁻³ mol/L，因此与检测到的IC50（10⁻³ mol/L水平）相当，从而突出了D. hansenii菌株用于生物生产2-苯乙醇作为抗真菌剂的潜在应用。此外，2-苯乙醇是D. hansenii产生的众所周知的群体感应分子，被发现可上调D. hansenii中涉及粘附和滑动运动性的性状，增加在奶酪表面的定殖概率，进而有助于最终产品的质量。
乙酸是一种常见的抗微生物化合物，其抗真菌活性已被充分研究。在本研究中，乙酸对反色枝孢霉和娄地青霉的IC50在10⁻³ mol/L。有研究报道了乙酸对娄地青霉生长的最低抑制浓度（MIC）为2.5±0.6×10⁻² mol/L（5天后），这略低于本研究中防止娄地青霉菌丝体膜形成的乙酸浓度（约10⁻¹ mol/L，7天后）。在先前的研究中，MIC是在模拟酸面团的条件下使用改良MRS培养基在5天后测定的，而在本研究中，抑制是在MEB（霉菌最佳生长培养基）中培养7天后评分的。这些差异可以解释所确定浓度的不同。
在软奶酪中，2-戊酮已在卡门培尔、Vacherin、林堡、Trappist、戈尔贡佐拉和蓝纹奶酪中检测到，浓度高于0.5-61 ppm的气味阈值，贡献果香、丙酮、甜味和醚味。在本研究中，2-戊酮对反色枝孢霉和娄地青霉的萌发和菌丝体生长表现出微弱抑制效果。此外，本研究中D. hansenii产生的2-戊酮估计浓度低于检测到的IC50，但处于先前研究报道的气味阈值范围内。
本研究的结果表明，D. hansenii的抗真菌活性是复杂的，可能源于多种抑制性VOCs的协同和/或累加效应，而非单一化合物的效果。类似地，经证实的生物防治酵母异常威克汉姆酵母BS91和美极梅奇酵母MPR3对包装新鲜水果采后病原霉菌的生长抑制，被认为源于VOCs和CO₂的协同效应。此外，在植物乳杆菌无细胞上清液存在下对镰刀菌属生长的抑制，已被证明并非仅由乳酸菌产生的乳酸引起。此外，当前研究未调查的额外机制也可能增加D. hansenii的联合抗真菌活性，包括非挥发性化合物如杀手毒素，以及营养和空间竞争。由于奶酪加工中营养和空间通常有限，这可能尤其相关。有趣的是，从干腌肉制品分离的D. hansenii被报道在固体培养基上的共培养试验中抑制产毒青霉，这无法通过无细胞上清液或口对口试验完全复制。这表明有效的霉菌抑制依赖于酵母抑制因子的累加或协同效应，如营养和空间竞争以及可溶性化合物或VOCs的产生。类似地，满洲毕赤酵母已被证明在柑橘伤口中快速定殖和扩增，并在生长过程中产生八种VOCs，包括乙酸和2-苯乙醇，抑制了引起柑橘绿霉病的指状青霉的生长。
总之，D. hansenii的遗传差异以及多样的酸化或脱酸化能力得到了确认。D. hansenii菌株的无细胞上清液对反色枝孢霉和娄地青霉表现出强抑制效果。使用DHS-GC-MS，鉴定出D. hansenii菌株产生的71种VOCs。在VOCs中，五种VOCs（乙酸、丙酮、3-甲基丁酸、2-戊酮和2-苯乙醇）与反色枝孢霉和娄地青霉的萌发抑制获得强相关性，而2-苯乙醇还与娄地青霉菌丝体生长抑制强相关。3-甲基丁酸对两种霉菌物种的萌发和菌丝体生长表现出最强的抑制效果，即IC50分别为10⁻⁵和10⁻⁴ mol/L。2-苯乙醇和乙酸在IC50为10⁻³ mol/L时也表现出对萌发和菌丝体生长的强抑制效果。本研究获得了2-戊酮和丙酮的相对较弱抑制效果。当前研究的结果指出D. hansenii产生的抗真菌化合物具有累加和可能的协同效应，这需要进一步研究。从整体角度来看，可以得出结论，乳制品制造环境中的一些本土D. hansenii菌株在奶酪的天然保存中具有迄今为止被忽视的作用，有资格用于奶酪生产中污染霉菌的生物防治。研究结果还指出，嗜盐D. hansenii菌株作为生物防治剂即将被用作乳制品工业中的生物保护培养物，例如作为奶酪盐水的添加剂。
数据可用性声明
本研究中提出的原创贡献包含在文章/补充材料中，进一步咨询可联系通讯作者。
作者贡献
CH、LZ、PJ、NA和LJ构思和设计研究。MP贡献于GC-MS分析。CH进行实验并起草手稿。PJ、NA和LJ修改手稿。所有作者对文章做出贡献并批准提交版本。
资助
本研究作为丹麦InBrine项目的一部分进行。作者感谢丹麦乳制品委员会（MFF）对研究的资助。额外资助由中国奖学金委员会获得。
利益冲突声明
作者声明，本研究是在不存在任何可被解释为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行的。
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