模拟失重条件下大肠埃希菌转录组测序、差异基因及富集分析结果（二）
随着我国航天事业的飞速发展，航天员在空间站工作的时间越来越长，在航天多种特殊环境中，失重一直是研究者们最为重视的一种环境。有研究表明，在航天失重环境中，人体的免疫力会有所下降，使航天员的身体对抗各种致病微生物的能力下降。同时，长期寄居于人体的正常菌群及条件致病菌在航天特殊环境中也同样会受到失重环境的影响。在航天飞行期间，这些细菌可以在失重条件下发生毒力、耐药性变化等，导致其致病性增强，从而使航天员患感染性疾病的可能性增加，也可对航天环境中的空气、水、食品安全性造成威胁。
大肠埃希菌是寄居于人体肠道内最常见的条件致病菌，在一定条件下可以引起胃肠道、泌尿道等多种局部组织器官感染，对人体健康具有潜在的威胁。既往研究表明，在模拟航天失重环境下，大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯菌等的基因表达可发生相应的变化，如在模拟失重条件下培养大肠埃希菌K12后，统计分析后发现了16个上调基因和19个下调基因；与正常重力组相比，在模拟失重环境下培养肺炎克雷伯菌14 d，共有171个基因表达失调，包括负责3型纤维体及其调节因子的基因，可导致其生物膜形成能力增强；一项研究证实，模拟失重诱导了鼠伤寒沙门氏菌163个基因差异表达，包括10个Ⅲ型分泌系统毒力基因(表达下调)，以及其他转录调节剂、毒力因子、脂多糖生物合成酶、铁酶利用和功能未知蛋白质的表达差异。寄生于人体内的大肠埃希菌长时间受到模拟失重环境的影响，会引起其基因表达变化，从而导致生物学性状和毒力改变，继而影响航天员健康和航天器环境生物安全。因此，研究模拟失重环境下大肠埃希菌基因表达的变化及其与生物学性状变化间的联系，可为航天员的身体健康提供保障，为未来的航天生物安全防护打好基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌种大肠埃希菌(CICC 10389)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
1.1.2试剂胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、RNA保存液、Total RNA Extractor购自生工生物工程(上海)股份有限公司；Qubit 2.0 RNA检测试剂盒、Qubit RNA检测试剂盒、Qubit DNA检测试剂盒购自美国Life Technologies公司；Ribo-off rRNA Depletion kit(bacteria)、VAHTSTMStranded mRNA-seq V2 Library Prep Kit for Illumina®、VAHTSTMDNA Clean Beads购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司。
1.1.3仪器Gravite重力控制系统；恒温培养箱；恒温振荡器；恒温振荡培养箱；生物安全柜；生物安全型离心机；Qubit 2.0荧光计、Qubit荧光计；微型漩涡混合仪；台式高速低温离心机；电泳仪；生物电泳图像分析；微量分光光度计；PCR仪。
1.2方法
1.2.1培养基配置
溶菌肉汤(Luria-Bertani，LB)液体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 5 g，溶解在1 L双蒸水中，121℃高压灭菌30 min后，于4℃保存。
LB固体培养基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 5 g，琼脂粉20 g，溶解在1 L双蒸水中，121℃高压灭菌30 min后，将液体倒入细菌培养皿中，凝固后放至4℃保存。
1.2.2大肠埃希菌培养
为明确模拟失重条件对大肠埃希菌基因的影响，把大肠埃希菌分为两组(正常重力组和模拟失重组)进行比较。先将保存的单克隆甘油菌种接种到LB固体培养基上，37℃静置培养12 h后，挑取单克隆菌落接种在装有5 mL LB液体培养基的摇菌管中，37℃、200 r/min，过夜活化。将活化的菌液按体积比1∶500接种于装满新鲜LB液体培养基的培养瓶中(体积约73 mL)，排空气泡。模拟失重组将接种好细菌的培养瓶放置在Gravite重力控制系统上旋转培养，2 r/min，37℃；正常重力组将接种好细菌的培养瓶放置在恒温振荡器中，水平振荡培养，2 r/min，37℃。每24 h按体积比1∶500接种于装满新鲜LB液体培养基的培养瓶中进行传代，连续培养14 d。
1.2.3 RNA提取及质检
运用Total RNA Extractor试剂盒，将裂解后样品或匀浆液室温放置5～10 min，使得核蛋白与核酸完全分离。加入0.2 mL氯仿，剧烈震荡15 s，室温放置3 min。12 000 r/min 4℃离心10 min。吸取上层水相转移至干净的离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，室温放置20 min。12 000 r/min 4℃离心10 min，弃上清。加入1 mL乙醇(750 mL/L)洗涤沉淀。12 000 r/min 4℃离心3 min，弃上清。室温干燥5～10 min。加入30～50μL RNase-free ddH2O，充分溶解RNA。将所得到的RNA溶液置于-70℃保存或立刻用于后续试验。用Qubit 2.0检测RNA浓度，琼脂糖凝胶检测RNA完整性以及基因组污染情况。质检结果显示样本质量均基本满足建库测序质量要求。
1.2.4原核RNA转录
组建库该部分委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。具体步骤参照实验说明书。
1.2.5基因表达差异分析采用TMM对read count数据进行标准化处理，之后运用DEGseq进行差异分析，为了得到显著差异的基因，我们将筛选条件设为：P≤0.05且|log2(Fold Change)|≥1。
1.2.6关键靶点的GO和KEGG富集分析借助GO数据库和KEGG数据库，使用clusterProfiler进行功能富集分析，P<0.05表示该功能存在显著富集情况。