一株兼具固氮、溶磷、解钾功能的不动杆菌A11的基因组解析及促生特性研究
1 材料与方法
1.1 样品
采样点位于新疆维吾尔自治区阿勒泰地区布尔津县大豆植株分布区域(87°29′81.86″E, 47°81′43.46″N)，该种植地区较为干旱，土壤质地主要为保水保肥性能较差的砂质土。‘黑农87号’大豆由黑龙江省农业科学院大豆研究所选育。
1.2 培养基、主要试剂和仪器
LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，NaCl 10.0，琼脂18.0-20.0，pH 7.0-7.2；阿须贝(Ashby)无氮培养基(g/L)：甘露醇10.0，KH2PO4 0.2，MgSO4·7H2O 0.2，NaCl 0.2，CaCO3 5.0，CaSO4 0.1，琼脂18.0-20.0，pH 7.0-7.2；蒙金娜有机磷培养基(g/L)：MnSO4·H2O 0.03，FeSO4·7H2O 0.03，CaCO3 5.00，葡萄糖10.00，(NH4)2SO4 0.50，卵磷脂0.20，NaCl 0.30，KCl 0.30，酵母膏0.40，琼脂18.0-20.0，pH 7.0-7.2；无机磷培养基(g/L)：葡萄糖10.00，MgCl2·6H2O 5.00，MgSO4·7H2O 0.25，KCl 0.20，(NH4)2SO4 0.10，Ca3(PO4)2 5.00，琼脂18.0-20.0，pH 6.8-7.0；解钾培养基(g/L)：葡萄糖10.0，Na2HPO4 0.2，MgSO4·7H2O 0.2，NaCl 0.2，CaSO4 0.2，CaCO3 5.0，钾长石粉2.5，琼脂18.0-20.0，pH 7.0-7.2；以上均为固体培养基配方，液体培养基不添加琼脂。5%绵羊血的胰蛋白胨大豆琼脂(tryptic soy blood agar, TSBA)培养基，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司。
比克曼革兰氏染色液试剂盒，湖南比克曼控股有限责任公司；固氮酶(nitrogenase, NITS)酶联免疫试剂盒，上海科兴商贸有限公司；细菌基因组DNA抽提试剂盒，生工生物工程(上海)股份有限公司。全波长酶标仪，Tecan Austria GmbH公司；荧光计核酸定量仪Qubit，Life Technologies公司。
1.3 根际促生菌的筛选与保藏
无菌操作条件下，取附着于植株根际(包括根瘤表面)的土壤2.0 g，加入150 mL锥形瓶，将该土壤用无菌水稀释至10-4，涂布至LB培养基上，于恒温培养箱中28 ℃倒置培养3-7 d。根据颜色、形态等挑取单菌落，反复划线分离直至获得纯培养物。将分离获得的纯化物分别进行4 ℃斜面保藏与-20 ℃甘油保藏。
1.4 菌株形态学鉴定及生理生化分析
形态学鉴定参考文献对LB培养基纯化后菌株的单菌落进行形态特征观察，如菌落色彩、形状、透明度等。细菌革兰氏染色采用比克曼革兰氏染色液试剂盒进行测定。其他生理生化测定如菌株耐盐碱能力测定、生长曲线及接触酶等试验参照文献描述的方法。菌株溶血试验采用TSBA平板测定，在28 ℃恒温培养箱中培养3 d，观察其是否产生透明圈，进行溶血能力的鉴定。
1.5 菌株16S rRNA基因分子鉴定及系统发育分析
挑取纯化后A11单菌落于EP管底部，加入200 µL的5%无菌BT-Chelex 100 resin溶液，充分悬浮菌体后，沸水浴煮15 min，迅速置于-20 ℃速冻后室温解冻，4 ℃、6 000 r/min离心3 min，取上清液2 µL作为模板DNA备用。参照杨晏哲等方法利用细菌通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)对菌株进行16S rRNA基因的PCR扩增。PCR反应体系(25 µL)：Green Tap Master Mix酶12.5 µL，ddH2O 9.5 µL，正、反向引物(10 µmol/L)各0.5 µL，模板DNA 2.0 µL。反应条件：95 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，35个循环；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测后将PCR产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序结果上传EzBioCloud (https://www.ezbiocloud.net/identify)平台进行比对分析，并采用MEGA 11.0软件进行系统发育树的构建。
1.6 菌株A11全基因组测序及功能注释分析
采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株A11的基因组DNA，经过1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，Qubit定量检测DNA样本浓度，浓度纯度检测合格后进行下一步测序。测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，通过Illumina NovaSeq X Plus平台进行全基因组测序。获得的原始数据通过Fastp进行数据统计、质量评估及质量剪切。使用SPAdes软件对测序结果进行拼接，用GapFiller软件对拼接得到的contig进行gap填补，利用Pilon进行序列矫正。序列处理完成后使用NCBI Blast+将基因蛋白序列与COG、Swiss-Prot、TrEMBL等数据库进行比对，得到COG及GO功能注释信息，随后采用KAAS软件进行KEGG注释分析，筛选出固氮、溶磷等促生功能有关的基因信息。
1.7 菌株促生功能的测定
1.7.1 固氮功能测定
挑取纯培养物A11接种于Ashby无氮培养基，28 ℃培养5-7 d，根据细菌是否能在Ashby无氮培养基上正常生长来测定细菌是否具备固氮能力，并根据菌落生长直径判断其固氮能力大小。菌株的固氮酶活性采用NITS酶联免疫试剂盒，经酶标仪进行测定。
1.7.2 溶磷能力测定
将菌株A11分别接种于蒙金娜有机磷培养基和无机磷培养基，28 ℃恒温培养箱中培养5-7 d，测量其溶磷圈直径(D)和菌落直径(d)，计算解磷指数[即菌株产生的溶磷圈直径(D)/菌落直径(d)的比值]。同时进行定量实验，将细胞悬浮液调制OD600=0.5，以1%的接种量接种至50 mL液体蒙金娜有机磷培养基和无机磷培养基，30 ℃、180 r/min培养3 d，10 000 r/min离心15 min，取上清，采用钼蓝比色法测定上清液中有效磷含量。
1.7.3 解钾功能测定
定性实验是将纯化后的菌株接种至解钾平板上，28 ℃恒温培养箱中培养5-7 d，测量菌株产生的溶钾圈直径(D)和菌落直径(d)，并计算其比值，比值越大，解钾能力越强。定量实验参考吴红艳等方法采用火焰分光光度计测定上清液中的钾含量。
1.7.4 种子萌发促生试验
选取颗粒饱满、大小相同的黑农87号大豆种子，用95%无水乙醇浸泡进行表面消毒，再用无菌水清洗3-5次，置于无菌培养皿中，每个培养皿放置20粒种子，并在种子下方铺垫2层灭菌滤纸。于培养皿中加入5 mL无菌水作为不接菌的空白对照组，以接种相同体积A11菌悬液(OD600=0.5)作为处理组，各组均设置3个重复。观察种子的萌发率，测量种子的胚芽长并计算种子的发芽率。
1.8 数据处理
采用Excel 2016软件与SPSS 27.0软件进行数据统计处理及多样性分析，通过Levene’s test验证方差齐性后，采用独立样本t检验进行差异显著性分析，P<0.05代表有显著性差异。