超分子纳米纤维搭载工程化抗菌肽WMR-4防控尖孢镰刀菌
研究背景：本研究旨在应对由尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）引起的严重农业病害。该真菌病原体不仅造成每年超过2200亿美元的全球作物损失，还对免疫缺陷患者构成机会性感染威胁，死亡率可超过80%。当前依赖合成杀菌剂的防治方法面临耐药性发展和环境持久性等严峻挑战。因此，开发新型、可持续的抗真菌策略迫在眉睫。研究聚焦于一种经过工程化改造的抗菌肽——WMR-4。该肽源自盲鳗黏液中的天然抗菌肽Myxinidin，并通过引入非天然氨基酸Aib和D-型氨基酸替换，显著增强了其蛋白酶稳定性。体外实验证实，WMR-4对尖孢镰刀菌具有强烈的抑制活性，其作用机制是通过深度插入真菌细胞膜并引发聚集，导致膜通透性增加和内容物泄漏，从而实现溶菌效果。
研究揭示了一个关键瓶颈：尽管在液体培养中效果显著，但游离的WMR-4肽无法阻止真菌穿透纤维素屏障（模拟植物表皮），限制了其在复杂农业环境中的应用。为克服此限制，研究团队设计了一种超分子纳米纤维递送系统。该系统通过共组装技术，将WMR-4与一种细胞穿膜肽gH625共同展示在纳米纤维表面。这种设计不仅提高了肽的局部浓度和稳定性，还赋予了其穿透生物屏障的能力。本研究成功地将合理的抗菌肽设计与先进的纳米技术平台相结合。它不仅证明了WMR-4作为一种高效抗真菌候选物的潜力，更重要的是，开发出的超分子纳米纤维递送系统解决了抗菌肽在农业实际应用中的关键递送难题。
丹麦Biosense微生物生长动态监测系统（oCelloScope）的应用
oCelloScope微生物动态检测系统被专门用于定量评估抗菌肽WMR-4及其纳米纤维制剂对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）菌丝形成过程的抑制作用。将新鲜的分生孢子（1.5x10^4个/孔）重悬于发芽培养基（GM）中，并加入不同浓度的WMR-4或纳米纤维（NF）制剂。然后将样品置于96孔板中，由oCelloScope进行自动化监测。该设备会每30分钟自动扫描一次样品，持续14小时，从而对整个菌丝形成过程进行动态、无标记的追踪。oCelloScope通过一套集成的硬件和软件算法，实现了对真菌形态学的高通量、定量化分析。并自动生成反映真菌质量随时间变化的生长曲线。这些曲线以客观的数据形式，直观展示了不同处理组（如不同浓度的WMR-4）与对照组在菌丝生长动力学上的差异。使得研究人员能够精确判断何种浓度能有效延迟或抑制菌丝的形成。
实验结论
实验结果表明，抗菌肽WMR-4对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）具有强效且剂量依赖性的抑制作用。其核心作用机制是溶菌性的。与针对细菌或白色念珠菌时表现出的非溶菌性机制（如地毯式模型）不同，WMR-4在面对模拟尖孢镰刀菌的脂质体膜时，表现出独特的双重作用。荧光淬灭和蛋白酶切实验证实，WMR-4的色氨酸残基能够深度插入真菌细胞膜的疏水核心，使其免受水溶性淬灭剂和蛋白酶的攻击。抗菌肽WMR-4能引发显著的膜融合（~60%）和内容物泄漏（高达90%），同时硫黄素T实验表明其在膜上发生聚集。这些特征共同指向一种高效的、通过破坏膜完整性来杀灭真菌的机制。WMR-4是一种作用机制明确、具有强大抗真菌潜力的候选肽。然而，其实际应用的成功高度依赖于先进的递送策略。所开发的超分子纳米纤维系统通过提供稳定的局部浓度、增强的屏障穿透和表面成膜能力，成功地将WMR-4的体外活性转化为在模拟农业环境中的高效保护，为开发新一代基于抗菌肽的智能农业防护材料奠定了坚实的实验基础。
图1、WMR-4抑制尖孢镰刀菌的生长和生殖管形成。面板A：生长抑制动力学显示在所有测试浓度（10–100微米）下均显著减少生物质，30微米≥观察到平台效应。面板B：生殖管形成分析显示，浓度依赖性抑制，最大减少效果为≥30微米。面板C：代表性显微镜图像，显示在浓度范围内逐渐抑制萌发。数据代表了生物复制±标准差的指标。比例尺=50微米。
图2、WMR-4膜与LUVs的相互作用，模拟尖孢霉膜。A面板：脂质混合测定。B：泄漏测定。C：通过ThT分析法进行聚合。D–F：SUV在0.02 M至0.16 M（D）丙烯酰胺淬火后的荧光Trp光谱，数据采用Stern–Volmer方程（E和F）。G和H：WMR-4在缓冲液（G）和LUVs（H）中激发为355 nm的荧光发射，切割乳糜蛋白酶切割前后。
图3、WMR-4不抑制尖孢镰刀菌透膜性。A：尖孢镰刀菌在置于最小培养基（MM）上的纤维素膜上侵入性生长，无论是否使用80μM WMR-4。在拆除玻璃纸前后对板材进行成像，以观察玻璃纸穿透情况。比例尺，1厘米。B：定量灰阶分析显示与对照组相比，表面和渗透真菌生物量无显著减少。
图4、纳米纤维（NF）的示意图
图5、NFs仅在高浓度下抑制尖孢镰刀菌生殖管的形成。A：生长动力学显示在测试的NF浓度（2.5–40微米）下，对真菌生物量积累影响极小。B：生殖管形成分析显示仅在最高浓度（40微米）下具有显著抑制效果。C：显微镜图像，确认浓度依赖性对萌芽形态的影响。比例尺=50微米。数据表示通过单向方差分析（ANOVA）±生物复制体的均值。
总结
本论文研究聚焦于一种经过工程化改造的抗菌肽——WMR-4。该肽源自盲鳗黏液中的天然抗菌肽Myxinidin，并通过引入非天然氨基酸Aib和D-型氨基酸替换，显著增强了其蛋白酶稳定性。体外实验证实，WMR-4对尖孢镰刀菌具有强烈的抑制活性，其作用机制是通过深度插入真菌细胞膜并引发聚集，导致膜通透性增加和内容物泄漏，从而实现溶菌效果。本研究成功地将合理的抗菌肽设计与先进的纳米技术平台相结合。它不仅证明了WMR-4作为一种高效抗真菌候选物的潜力，更重要的是，开发出的超分子纳米纤维递送系统解决了抗菌肽在农业实际应用中的关键递送难题。
这种模块化平台技术可通过替换不同的抗菌肽，灵活应对多种植物病原体，为开发可持续、高效且可能规避传统耐药性机制的下一代作物保护策略提供了强有力的理论和实践依据，对保障全球粮食安全具有重要意义。oCelloScope自动化成像系统被专门用于定量评估抗菌肽WMR-4及其纳米纤维制剂对尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum）菌丝形成过程的抑制作用，通过一套集成的硬件和软件算法，实现了对真菌形态学的高通量、定量化分析。自动生成反映真菌质量随时间变化的生长曲线。这些曲线以客观的数据形式，直观展示了不同处理组（如不同浓度的WMR-4）与对照组在菌丝生长动力学上的差异，CelloScope在论文研究中扮演了一个高通量、高内涵的表型分析平台的角色。它超越了传统终点法或手动显微镜观察的局限，通过自动化、定量化的动态监测，为以下关键科学论断提供了至关重要的实验证据。
相关新闻推荐
2、藜麦和蓝靛果酵母菌株筛选、培养、计数及混菌液态发酵工艺优化（四）