新疆特殊生境大豆根际促生菌A11的筛选、多功能特性及基因组学研究
2.3 菌株促生功能的分析
2.3.1 菌株A11固氮、溶磷、解钾能力的评价
促生功能试验结果初步表明，菌株A11兼具有固氮、溶磷、解钾功能(图6)。菌株A11经恒温培养后能在Ashby无氮培养基上正常生长，说明其具有固氮功能(图6A)。进一步定量实验发现，该菌株培养3 d后菌株的固氮酶浓度能达到(296.22±4.37) ng/L。有机磷定性实验结果如图6B所示，菌株A11能在蒙金娜有机磷培养基生长且产生透明圈，解有机磷指数D/d=1.70±0.05。解无机磷能力测定结果如图6C所示，菌株A11的解无机磷指数D/d=1.80±0.08；进一步的溶磷定量试验结果表明，菌株A11经培养3 d，对卵磷脂的转换量达到(3.96±0.05) mg/L，对磷酸钙的转换量达到(32.96±0.45) mg/L。解钾功能定性测试结果如图6D所示，结果表明菌株A11的解钾指数D/d=2.17±0.03。进一步的解钾能力定量试验结果表明菌株A11对钾长石粉的转换量为(5.91±0.53) mg/L。
2.3.2 菌株A11促进种子萌发能力的评价
相较于不接种对照组，接种菌株A11的处理组对大豆种子萌发具有显著促进作用(图7)。不接菌对照组(CK)的大豆种子发芽率为(70.00±4.08)%，而接菌处理组下大豆种子的萌发率达(98.33±2.36)%，较对照组显著提高了40.47%；同时，接菌处理组大豆胚芽长度较对照组也显著增加98.13%。
3 讨论
不动杆菌属(Acinetobacter)隶属于假单胞目(Pseudomonadales)莫拉菌科(Moraxellaceae)，在土壤中分布范围较广，通常存在于多种植物的根际，并且大多具备耐盐与促生功能。大量研究表明不动杆菌因具有固氮、解磷、产IAA与赤霉素等促进植物生长的功能，在农业领域得到了广泛的应用，尤其是在促进种子萌发、幼苗生长、提高农作物产量、品质和改善土壤特性等方面起着重要的作用。本研究通过稀释涂布平皿法从新疆干旱生境下生长的大豆作物根际分离并筛选出一株兼具多种促生功能的菌株A11，基于16S rRNA基因测序及全基因组测序结果初步鉴定为皮特不动杆菌(A. pittii)，保藏于中国典型培养物保藏中心(保藏编号为CCTCC M20242725)。菌株A11生理生化分析结果表明，菌株A11能够耐受1.5% NaCl，并在pH 4.0-9.0的范围内生长良好，说明其具备一定的耐盐碱特性，这与前人发现相似。
众多研究表明不动杆菌是土壤生态环境中具有巨大挖掘潜力的根际有益促生菌。本研究促生性能结果表明菌株A11具有良好的固氮功能，其固氮酶浓度能达到(296.22±4.37) ng/L，明显高于徐云龙等研究分离获得的一株自生固氮菌固氮酶浓度(220.51±8.21) ng/L。不仅如此，本研究中菌株A11同样表现出了良好的溶磷能力，并且同时具备溶解有机磷和无机磷的能力，对卵磷脂的转化量为(3.96±0.05) mg/L，对磷酸钙的转化量也能达(32.96±0.45) mg/L，与赵健淞等发现的A. baumannii PSB-K解磷能力相当。
另外，本研究分离的菌株A11还表现出良好的解钾能力，解钾指数为2.17±0.03，对钾长石粉转换量达到了(5.91±0.53) mg/L。这与黄臣等研究发现的2株乙酸钙不动杆菌(A. calcoaceticus)具备的解钾能力相当；吕欢欢等研究表明A. pittii YC-25兼具溶解无机磷、解钾等多种促生功能，其解钾指数为1.31，而本研究发现的菌株A11解钾指数约为其2倍。菌株A11种子萌发促生试验结果分析发现，接种菌株A11后的大豆种子萌发率提高40.47%，胚芽长度增加了98.13%，这些研究表明菌株A11是一株兼具多种不动杆菌功能特质，表现出更优能力的促生菌株。
菌株A11全基因组数据分析结果表明，其基因组中包含大量与能量生成、转换、代谢及转录相关的基因，这些功能基因与菌株固氮、溶磷及解钾等促生特性密切相关。本研究中，该菌的基因组中存在大量与氮代谢有关的基因，分别为编码谷氨酸合酶与转运相关基因(glu, glt)、编码谷氨酰胺合酶的基因簇(gln)、氨转运蛋白编码基因(amt)，以及硝酸盐还原酶编码基因簇(nas)等。
这些基因在其他促生菌中被报道参与氮固定作用，因此推测菌株A11的固氮作用机制可能是通过基因amt及nas间接调控硝酸盐转运系统转化环境中的硝酸盐，通过合成gln等调节固氮酶活性将氮气转化为可供植物生长吸收利用的氨，直接为植物提供氮源。此外，发现大量与磷代谢相关的基因，主要包括葡萄糖酸有机酸代谢相关基因(gdh, pqq, phn, pho)，磷酸盐转运蛋白编码基因(pst, ugp)，磷酸盐信号调控代谢活动相关的双组分调节系统(phoR, phoB)等与溶磷密切相关基因。Guo等通过全基因组测序发现甘蔗促生菌铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) DJ06具有glt、pst和pho等多个重要的涉及促生作用的基因。
Wagh等报道了一株水稻内生菌草螺菌(Herbaspirillum seropedicae) Z67能够通过合成pqq和gdh基因来显著增加宿主体内的磷含量。李欣等发现Pseudomonas sp. GAJR-8菌株中的pqq、gdh基因缺失会导致其溶磷能力显著降低。另外，该菌中关于钾代谢相关的基因主要为钾转运(kdpA, kdpB, kdpC, kdpD, kdpE)、钾外排系统(kefC, kefF)及钾吸收(trkA, trkB, kup)等相关基因，这些基因可能通过互相作用来调控钾离子浓度，维持细菌正常生理活动。刘欢等在解盐促生菌霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei) Wu-15中也发现kdp等相关基因参与其解钾。因此，本研究推测菌株A11极有可能也是通过这些基因来调节磷酸酯酶、有机酸等活性物质的分泌和合成来溶解土壤中的难溶性磷和钾长石等，协同改善土壤肥力并促进作物生长发育。
同时，在菌株A11的基因组数据中还发现了一组与细菌铁载体合成有关的功能基因(vib、fhu和fts等)，这与张婷等报道的玉米根际促生菌非脱羧勒克莱尔氏菌(Leclercia adecarboxylata) LN01中参与铁获取的fhu基因相同，也说明该菌株可能具备合成铁载体的能力。目前相关研究表明单一菌株接种可能在田间应用中存在效果不稳定、适应能力差等问题，未来研究可通过优化菌株发酵条件及田间施用匹配性等策略提升其田间应用效果。此外，构建以A11为核心的复合功能菌群，有望通过菌种协同作用增强其定殖能力与促生稳定性，并为将来探索其在不同作物与土壤类型中的促生效应及应用效果提供重要支撑。
4 结论
本研究首次报道了从新疆维吾尔自治区阿勒泰地区干旱生境下大豆植株根际筛选的兼具多种优良促生特性的一株不动杆菌A11，通过对该菌株多功能促生特性与全基因组相关基因的深度分析，挖掘了该菌株中可能参与固氮、溶磷等促生过程的关键功能基因，初步探究了其多功能促生潜在的相关分子作用机制的原因。该菌株所具备的优良菌种资源特性，将为农业领域相关微生物菌肥、菌剂的开发及应用提供广阔前景。同时，也为未来开展菌株A11及其功能菌群与不同作物的适配性评价、田间施用技术的优化提供了关键支撑，将有力推动其在农业增产与土壤改良等实际生产中的应用。此外，本研究也将为进一步推进不动杆菌促生及抗逆等相关分子机制的探索提供重要的科学依据。
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