生长曲线测定法和菌落计数法确定YchJ对鼠伤寒沙门菌抗逆能力的影响——摘要
摘要：目的了解ychJ基因及其编码蛋白YchJ对鼠伤寒沙门菌抗逆能力的影响。方法基于ExPASy ProtParam tool和Clustal Omega对YchJ蛋白性质及氨基酸序列保守性等生物信息学进行分析和预测。采用CRISPRCas9法构建鼠伤寒沙门菌ATCC14028s的ychJ基因敲除株△ychJ,并通过DNA扩增技术进行鉴定。分别对野生株和敲除株进行抗逆功能试验，通过结晶紫半定量法和刚果红染色法确定YchJ对沙门菌生物膜形成的影响；采用生长曲线测定法和菌落计数法确定YchJ对沙门菌抗生素耐受能力的影响；利用半固体平板移动法检测YchJ对沙门菌运动能力的影响。结果YchJ是一种稳定的亲水性蛋白，其氨基酸序列相对保守，ychJ基因敲除株构建成功。与野生株的RDAR表型（红色、干燥和粗糙）相比，该敲除株表现为SAW表型（光滑、白色、湿润）。经结晶紫染色后，野生株的A570/A600值为0.8345±0.1016,显著高于ychJ敲除株的0.2633±0.05051.在抗生素耐受性实验中，低浓度氨苄青霉素或诺氟沙星压力下，ychJ敲除株的生存能力显著降低，仅为野生型的10%-60%.在半固体平板实验中，ychJ敲除株的扩散直径达到（5.00±0.10）cm,显著大于野生株的（1.933±0.1155）cm,表明ychJ敲除株表现出更强的移动能力。结论未知功能蛋白YchJ的缺失会影响鼠伤寒沙门菌的运动能力、生物膜形成能力和抗生素耐受能力，为沙门菌及其他胞内寄生菌YchJ功能的确定提供理论基础。
鼠伤寒沙门菌是一种兼性胞内寄生的革兰阴性菌，能通过污染的水和食物进入人体肠道，侵入小肠绒毛上皮细胞进入宿主体内，而后被巨噬细胞吞噬，随巨噬细胞扩散到淋巴结、肝脏和脾脏，进而引发全身多器官感染和菌血症。据估计，全球每年有超过9万人死于与沙门菌感染引发的疾病，且其耐药性也不断增强，已被世界卫生组织认定为“15种严重耐药的病原菌”之一。因此，沙门菌作为“对公共卫生最具威胁的细菌”之一，对其致病机制的深入备受关注。
在侵染宿主过程中，沙门菌面临一系列生存压力，包括营养匮乏、环境变化、宿主免疫系统的攻击、以及抗生素的杀伤，宿主通过这些不利压力环境来快速杀灭沙门菌。然而，在与宿主相互作用过程中，沙门菌通过一系列适应性防御机制来应对这些挑战。鞭毛作为沙门菌的运动器官，不仅通过趋化性引导沙门菌找到最佳的感染部位，还帮助其逃避宿主免疫细胞的捕获。生物膜可作为自我保护屏障帮助沙门菌抵御宿主各种环境压力、免疫系统攻击和抗生素杀伤，从而提高沙门菌的生存能力。此外，沙门菌还可以通过调节关键蛋白的表达水平来增强其对抗生素的耐受性。这些机制不仅增强了沙门菌在宿主体内的生存和繁殖能力，还可导致其耐药性的产生，增加治疗的难度。因此，探究沙门菌所面临的生存压力及其应对机制对开发新的抗菌药物靶标和制定有效预防策略至关重要。
YchJ是细菌的未知功能蛋白之一，其相关研究鲜有报道。前期研究表明，YchJ影响大肠埃希菌生物膜的形成和蛋白质的分泌，提示YchJ可能在大肠埃希菌的抗逆能力中发挥重要作用。目前，沙门菌YchJ蛋白功能的相关及该基因缺失后对于菌株的影响尚不清楚。因此，本研究基于CRISPRCas9技术成功构建鼠伤寒沙门菌ychJ基因敲除株，比较野生株和敲除株的运动能力、生物膜形成能力和抗生素耐受能力，旨在为沙门菌及胞内寄生菌YchJ功能的确定提供理论基础。
1、材料与方法
1.1菌株及质粒
鼠伤寒沙门菌ATCC14028s（WT菌株）菌株购于美国ATCC菌种库，CRISPRB质粒购于广州源井生物科技有限公司。
1.2主要试剂和仪器
引物序列由铂尚公司合成；PCR基因扩增仪购自美国Thermo公司；氨苄青霉素（Amp）和诺氟沙星购自北京索莱宝科技有限公司；mRNA逆转录试剂盒购自南京诺维赞公司；mRNA提取试剂盒购自山东思科捷生物技术有限公司；实时荧光定量PCR试剂盒购自Takara宝日医生物技术（北京）有限公司；全自动生长曲线分析仪以及生长曲线分析仪专用微孔板均购自丹麦Biosense公司。
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